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housekeeping gene의 Ct 값이 1 차이가 나는정도는 제 손에서도 흔히 나오는 결과인데 다른분들은 안그러나보죠? RNA prep중이나 cDNA 합성중에 차이가 날 수도 있고 1정도는 차이가 날 수 있습니다. Target도 함께 차이가 나겠지요. 그래서 duplication triplication을 하는거구요.
뭐..차이는 있다지만...
어느 수준(숫자)에서 차이가 나는지 궁금하군요...
CT: 14~16은 위험하고, 18정도면 무난합니다.
1. 그래서 중요한게 샘플의 숫자 입니다.
: 대조군, 실험군 기본 3개씩은 해야하고, 그래야 잘못된 실험부분을 알수 있습니다.
RT의 경우는 더 있을수록 좋습니다.
(하나가 삐딱한 값 하나 뺴면 되거덩요~)
2, RNA 뽑을때 시료는 비슷하게 시작하심이....
: 저야 cell보다는 주로 즉석에서 쥐를 잡아다가 조직에서 뽑는데..일정 위치, 양이 중요하더군요...
3. 위에서 잠깐 나왔지만, cell이던 조직이던 저장했다가 나중에 뽑지마세요=즉석에서 처리하십시요!! 뽑을 시간이 없으면(귀찮으면), 트리졸에라도 담가 얼리고 담날 하세요...
: 실험은 무조건 Fresh입니다~그나마 트리졸은 안정적입니다.
4. cDNA 만들기 전, 스펙트로메터를 이용하여, RNA 순도체크와 양을 꼭 통일 시킵시다!
(엔자임을 활성도를 고려하여, 메뉴얼데로 넉넉하게...)
: GAP이나 ACTin같이 양이 많은 endogen에 효소가 적게 들어가면, 많은애들이 먼저 효소랑 반응해서 만들어지겠지요? 그리고 나머지 소량의 타겟gene이 반응 안한다면.??
5 .위4번과 또 연관되지만..순도가 무척 중요합니다.
: array나 NGS에서도 많이 나오는 내용이지만, RNA 쪼금만 로딩해보고 cDNA작업 들어가도 좋은 방법입니다.
: RT값나오기까지 빨리해도 3시간인데, 실험 망치면 정신적 충격이 더 커집니다.
그냥 참고하시기 바랍니다~~
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