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 전체 > Molecular Biology-DNA > PCR/RT-PCR/Q-PCR
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질문 PCR 관련..
초보아가씨  | 2007.08.08 17:47
답변있는 질문은 수정/삭제 불가(☞문의)
원래 genome사이즈는 5.784kb인데 vector에넣었더니 원래 사이즈보다 작은 genome이생겼습니다. 그래서 원래 사이즈의 genome을 얻기위해 primer를 이용해 앞뒤로 genome을 합성하는 PCR을 하고 있습니다.

전체 DNA sequence는 알고 있고 저는 현재 가지고 있는 genome사이즈의 반(약2.5kb)을 잘라 앞부분을 늘리는 PCR하고 있습니다. PCR은 총 4번하고 지금까지 두번은 PCR로 DNA합성이 되었는데 세번째 PCR이 되지않습니다. 세번째 PCR을하면 DNA사이즈가 0.5kb에서 band가 나타납니다.denaturation은 보통94도애서5분으로했고 annealing temperature는 60도나 58도에서 45초하였고 polymerization은 72도에서 2~3분 하였습니다. 사이클수는 30~35정도로 했구요.

gradient PCR도(55-64도) 해봤지만 결과는 마찬가지였습니다. 두번 primer를 다시 제작해봤지만 소용없었습니다. polymerase는 pfu를 사용했습니다.
#PCR
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초보아저씨  |  2007.08.09    
머리 복잡해 자세히 모르겠고.. 잘안된단건 딴분께 패스..

insert는 사이클 25~30만 하세요.
예전에 s1 nuclease 처리해보니 사이클 증가하면 엄청나게 부서짐을 알수 있어요.
폴리모피즘 볼땐 많아도 무관하지만.. 물론 이때도 single strand는 다르겠죠.
cloning 할땐 줄이는게 혹시라도.. 어차피 dna 부족할 일 없죠 ?

size가 작아진다면 아마 annealing이 잘못되는거 외에 답이 있나요?
일단 5kb중에 pcr 되는 부분의 시퀀스를 짤라내고
그걸 가지고 멀티얼라인을 하든 컴에 앉아 자꾸 붙여 보세요.
primer 안되면 버리고 즉시 퀵 주문해서 하세요.
온라인 프로그램보다 맨눈으로 보고 그냥 짜도 되고..
그땐 multialignment 프로그램 브릭에 좋은 것 있으니 참고하시고..
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