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질문 Ni-NTA 정제가 갑자기 안됩니다.
알정제  | 2014.03.24 16:48
그동안 Ni-NTA resin을 사용하여 효소를 정제 하였는데 갑자기 정제가 안 되기 시작했습니다.

정제가 안 되길래 효소를 발현시켜 sds-page로 분석하였을 때 상등액이랑 펠렛에서 전혀 발현이 

안되는 것을 확인하고 형질전환을 다시 하였습니다.

다시 형질전환 시키고 sds-page로 상등액이랑 펠렛에서 발현이 되는 것을 확인했는 데 문제는

정제를 다시 하니 안 나오더라구요

시약도 새로 사서 했는 데도 나오지를 않더군요..

원인을 잘 모르겠습니다.

제가 생각하는 원인은 

1. Wash I, Wash II buffer 시약이 오래됐기 때문 (제조한지 8개월 쯤 되었습니다.)
2. DH5a로 추출한 플라스미드가 오래됐기 때문(추출하고 보관한 기간이 1년 반쯤 되었습니다.)
이렇게 생각하고 있습니다.

단순한 화학공학 전공자라 이 분야에 대해 좀 어렵기도 합니다. 

정제가 안 되는 원인이 무엇인지 정말 궁금하네요...



#Ni-NTA
 
#정제
 
#효소
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
개구리Kim  |  2014.03.24   
단백질은 plasmid를 새 컴셀로 transformation하고 뜬 colony를 키워서 뽑는게 가장 잘 나옵니다. miniprep을 자주 할 필요는 없고, 그냥 좋은 컴셀만 쓰면 됩니다.
대왕개구리안재진  |  2014.03.25   

단백질은 발현이 된다...
정제를 하니 elution에 내 단백질이 없다...
결국 내 단백질은 어디에 있냐부터 찾야하 합니다.
sample loading 단계에서 떨어 졌을수도 wash단계에서 떨어졌을수도 elution에서 안 떨어지고 resin에 있을수도 있습니다.
각 프렉션을 다시 분석해서 단백질 위치부터 찾는게 선행되어야 해결할수 있습니다.

박사과정  |  2014.03.25    
버퍼를 만든지 8개월.. 너무 오래됐군요
냉장보관을 잘하더라도 상태가 않좋을 수 있습니다.
버퍼가 상해서 pH가 안맞을 수도 있고, 
혹은 Ni-NTA resin의 상태가 않좋을 수도 있겠네요
우선 control실험으로 His-tagged protein을 정제해볼 필요가 있을거 같습니다.
버퍼는 무조건 다시 만드시는걸 추천합니다.
그리고 resin에 문제가 있을경우에 Cleaning을 하시거나, 새로운 resin을 사용해보십시요

플라스미드는 아무리 오래되어도 문제없습니다.
competent cell만 fresh한것으로 tranformation만 최근에 했으면됩니다
개구리얼음보송이  |  2014.03.27   

일단 기초적인 실험을 해야 할것 같습니다.

soluble한 protein을 Ni-NTA resin으로 정제할때 bacterial cell pellet을 sonication후
상층액만 회수해서 정제하게 됍니다.

이 lysate(용해물)을 Ni-NTA resin이 차있는 column에 걸려서 affinity chromatography을 하게 되는데요

lysate sample 1ml
lysate flow through sample 1ml
Wash 1, 2, 3~ flow through sample 1ml (순차적으로 각각)
elutipn sample

이렇게 sds page를 하셔서 확인하셔야 합니다. 6xhis-tag 으로 정제 하시는 것일 건데 단백질이 발현을 했다면 어딘가에는 있을것인데 이것을 확인해야 합니다.
lysate sample 에는 당연히 원하는 protein band가 있겠죠?

lysate flow through sample 에는 없어야 정상이고 만약 있다면 6xhis tag이 Ni-NTA resin에 안붙는다는 얘기인데 이경우 Ni-NTA resin이 문제일겁니다.

Wash flow through sample 이때 원하는 protein이 빠져 나왔다면 새로 buffer 만드셔야합니다.  wash buffer는 원하는 protein을 제외한 다른 잔여 protein을 제거시키기 위한 것이라 빠져나오면 안됍니다.

elution 한뒤에 도 나오지를 않는다면 새로 elution buffer 만드시면 되겠습니다.
새로 만들었는데도 elution이 안된다면? 시약의 농도를 조절해야합니다. imidazole과 6xhis tag이 경쟁적 반응으로 imidazole농도가 높아질수록 6xhis tag이 떨어집니다. 만약 다시만든 elution buffer에서도 용출이 안되면 imidazole농도를 좀더 올려 만들어 볼 필요가 있겠습니다.

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