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 전체 > Molecular Biology-DNA > Gene Cloning
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질문 cloning고수님들 자꾸 expression시 2 band가 나옵니다.ㅠ,,ㅠ
김만식  | 2014.02.03 10:17
답변있는 질문은 수정/삭제 불가(☞문의)
안녕하세요 석사 새내기 입니다.ㅠ,,ㅠ
cloning을 하여 bacteria에 induction을 하고  SDS-PAGE를 내리는데
자꾸 2 band가 나오네요 ㅠ,,ㅠ(target size는 70kDa, 불필요한  band size는 55kDa)
coomasie blue로 염색을 해도 western으로 해여도 2 band가 나옵니다.
심지어 control에서도 나오는것 같은데 이것은 어떻게 해야되나요?
온도를 낮추어도(21도씨) IPTG농도를 낮춰봐도(0.1mM) 시간을 늘리거나 줄여봐도(12~21hr)
항상 2 band가 나옵니다.정말 3달동안 조건만 잡다가 끝나는것은 아닌가 싶습니다.
이거 cloning이 잘못된것인 가요?
sequencing은 맞겨보았는데 잘못된것은 없었어요...
cloning잘 하시는 고수님들..... 도와주세요...ㅠㅠ

#cloning
 
#induction
 
#2band
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
흠.  |  2014.02.03    

벡터의 프로모터 터미네이터 사이 , 즉 님이 삽인한 gene근처까지의 sequence 정보를 다시 확인해보세요~될수록 최근 시퀀싱결과로..
코작시퀀스 위치나 코돈단위로 체크하여 스탑 코돈 체크해보세요. 스플라이싱에 의한 것인지..등등... 이 또한 클로닝 웍의 기본입니다..
시간대별 인덕션으로 체크해보지 않으셨다면 세균내 특정 단백질일 수도 있고,
둘다 문제가 없다면 컨탐된 세균일 수도 있으니 vector transformation을 새로운 세균에 해보시구요~
홧팅

대왕개구리엘피스  |  2014.02.03   

가능성은
1. another strat site
2. premature termination
3. internal cleave of expressed protein

모두 가능성이 있는 얘기들이며 한번씩은 경험해 본 일이 있습니다.

1의 경우, 중간에 rbs (ribosome binding sequence 보통은 AAGGAG 또는 유사서열) 서열이 있는지 확인해 봐야 하며 있다면 point mutation으로 변형해 주어야 합니다.

2의 경우에도 마찬가지로서 transcription이나 translation에 방해가 되는 서열이 존재하면 일어날 수 있는 문제입니다.

1, 2, 3의 경우 모두, n-term에 그리고 c-term에 각각 his tagging을 한 후, 각각을 정제해 보면 어떤 문제에 의해 발생한 현상인지 50%정도는 예측을 할 수 있습니다. 만약 1의 경우라면 N-term은 큰 size만 나와야 하며 C-term은 둘다 his정제로 나와야 하고, 만약 2의 경우라면 N-term은 둘다 정제가 되는 반면 C-term은 큰 size만 나와야 합니다. 3번의 경우하면 어떤 경우이던 둘다 나와야 합니다.

문제가 한번 생기면 이를 해결하는데 많은 시간이 들어갈 수 밖에 없습니다. 가장 좋은 것은 한방에 쭉 끝내는 것이지만 예측불가의 현상은 언제나 발생할 수 있고 만약 시간만 넉넉하다면 이를 해결하는 과정에서 오히려 더 많은 지식과 경험을 얻을 수도 있습니다.

개구리animanga  |  2014.02.03   

우선은, 우연찮게 cryptic ribosome binding site가 gene 내부에 있고 또한 그 근처에 ATG 등의 start codon이 존재하는지 살펴보세요. (원래의 ATG에서 약 400 bp downstream쪽)
만약 있다면, 55kDa 크기의 원치 않는 단백질이 추가적으로 발현되었을 가능성이 있습니다.

또 다른 가능성으로, 단백질을 발현했을 때 특정 위치에서 잘리는 경우가 있습니다. 이 경우는 균주를 바꿔보세요.

김만식  |  2014.02.06    
모두들 감사합니다.-- __(꾸벅)

고수님들께서 알려주신데로 하나하나 체크해서 해보도록 하겠습니다.

정말 감사합니다.~
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