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 전체 > Molecular Biology-DNA > Sequencing
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질문 Pyrosequencing (454 method) 원리 중 궁금한 점이 있습니다.
알Vitalise  |  2014.01.06 15:47
 안녕하세요.

 Pyrosequencing (454 method)의 원리 중 궁금한 점이 있어 질문드립니다.

 처음 Capture beads에 DNA 절편 한 개를 붙이기 위해서 restriction enzyme으로 DNA 절단을 한다고 이해하고 있습니다. 예를 들어 200bp DNA를 절단하면 10bp, 29bp, 52bp, 80bp 등등 여러가지 길이의 DNA 절편들이 나오겠죠? 그럼 그 절편들을 각각 Capture beads에 붙이고 emulsion PCR을 돌리고 PicoTiter에 로딩하여 Pyrosequencing 과정을 거쳐 염기서열을 알아냅니다.

 그렇다면 capture beads들은 각각 10bp, 29bp, 52bp, 80bp 등등 각기 다른 DNA 절편들을 가지고 있지요? 이것들을 무작위로 PicoTiter에 로딩하고서 pyrosequencing을 하는데 염기 순서들을 어떻게 확인할 수 있다는 것이죠? 각각 capture beads들이 가지고 있는 DNA 절편들의 sequence는 알 수 있지만, 절단되기 전 DNA strand의 sequence는 어떻게 알 수 있나요?
#pyrosequencing
 
#454 method
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
알sskim  |  2014.01.07   
안녕하세요.

우선 말씀하신 것중 restriction enzyme으로 자른다고 하셨는데 보통 NGS를 할 때는 sonication을 이용해서 random한 위치에서 DNA를 자릅니다.

그리고 200bp 길이의 DNA 분자가 한 개만 존재하지는 않겠죠? 이해를 돕기 위해 심플한 가정을 해서 200bp 조각 2개의 DNA 분자가 액체 안에 존재한다고 합시다. Sonication을 한 후 하나의 분자는 70bp위치에서 잘렸다 하고 다른 하나의 분자는 130bp 위치에서 잘렸다고 생각을 해보면 4개의 DNA 분자가 나오는데 
1. 1~70bp
2. 71~200bp
3. 1~130bp
4. 131~200bp 
와 같습니다.
이것을 시퀀싱 하면 4개의 조각의 시퀀스를 알 수 있고 <분자 '2'>와 <분자 '3'>의 시퀀스 정보가 일부 겹치는 것을 확인할 수 있을 겁니다(이 경우 71~130 bp 가 겹치겠죠). 이 겹치는 부분을 통해서 서로 다른 조각의 DNA 정보를 연결해서 잘리기 전의 정보를 복원합니다. 이 과정은 보통 bioinformatics 프로그램을 이용해서 진행이 됩니다.

Genome처럼 긴 길이의 DNA를 시퀀싱 할 때에도 마찬가지입니다. 랜덤하게 자르고, 조각들을 읽고 , 겹치는 부분을 찾아서  잘리기 전의 정보를 얻습니다.


썰렁이  |  2014.01.24    
다른 답변에 나온 것처럼 프로그램 써서 압니다.
ATTTGCCCTAAACCACGGG라는 서열이 있으면
ATTTGCCCTA, CTAAACCACG, AAACCACG, CCCTAAACCCA 등의 read가 나옵니다.
확실하게 많이 겹치는 부분을 찾아서 이어서 원래 서열을 알아내는 것이지요.
한글로 하자면 아기다리고기다리던데이트 가 있으면
아기다리고기다리, 다리고기다리던데, 리던데이트 가 있으면 다리고기다리 부분이랑 리던데 부분이 겹치는 그걸 보고 잇는 거죠.
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