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 전체 > Molecular Biology-DNA > Sequencing
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질문 시퀀싱 일치율이 96~97%입니다..
초보실험자11  |  2013.11.22 16:10
답변있는 질문은 수정/삭제 불가(☞문의)

1400bp정도와 2700bp의 유전자를 각각 동일한 벡터에 넣는중에 있습니다.

pET계열 벡터이니 다른 유전자 사용시 잘 클로닝해서 사용했던 벡터입니다.

이번에 새로 클로닝을하니 자꾸 일치율이 96~97%정도밖에 뜨지않습니다.

99~100%가 되어야 안심하고 실험을 진행할수 있는데

PCR부터 잘못되서 그런지 온도도 바꿔서 해보고 프라이머길이도 바꿔서 해봐도

일치율은 비슷합니다.



제가 생각하기엔 혹시 콜로니를 전배양하기위해 딸때 아주작은 위성들이 주위에 있엇는데

그걸 같이 따게 되서 일치율이 낮아지는건지..

아니면 PCR부터 뭔가 잘못되서 들어간건지 궁금합니다..ㅠㅠ

alignment해보면 중간중간 틀린 염기서열이 한두개씩 분포됩니다. 몇십bp가 불일치하는상황은 아니구요.

이럴땐 어떻게 하면 좋을까요?
#시퀀싱
 
#sequencing
 
#identity
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
개구리genyx  |  2013.11.22   
PCR하실 때 혹시 Taq을 쓰셨나요? Pfu를 쓰세요.
초보실험자11  |  2013.11.23    

시퀀싱의뢰할때 PCR을 떳던 프라이머를 이용했거든요.

그래서 이번엔 벡터에서 추천하는 시퀀싱용 프라이머로 다시 재주문 해서 체크해보려합니다.


PCR 떳던 프라이머가 상당히 길어서 40~50bp 사이..그래서 시퀀싱 읽을때 문제가 됫던걸까요>?
개구리genyx  |  2013.11.23   
PCR-error 문제인 것 같은데, 왜 엄하게 primer를 재주문한다는지 모르겠네요...PCR하실 때 어떤 polymerase를 사용하셨는지 체크해 보세요.
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