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self complementarity, self 3' complementarity 둘 다 낮은게 좋습니다. T는 다른 base보다 binding specificity가 떨어져서 3' 끝엔 되도록 T말고 다른 염기가 오는게 좋다고 하구요, 3' 말단에 GC contents가 연속해서 위치해 있는 것도 좋지 않다고 합니다.
그리고 선정한 primer 쌍은 blast 돌려서 mRNA refsequence에서 혹시 그 primer로 다른 gene의 mRNA가 증폭되지 않는지 확인하셔야 하구요,
프로그램상으로나 이론상으로 완벽해도 PCR돌려보면 nonspecific band가 많이 뜨거나 증폭이 안될 수도 있습니다. 일단 가장 괜찮다 생각되는 primer 주문하셔서 돌려보세요.