저는 Biotin label된 DNA를 이용하여 Gel retardation assay를 하고 있습니다. DNA size는 250bp이고 이것에 대한 binding protein은 25kD입니다. 이둘을 mix 하여 5% acrylamide gel (native gel TBE buffer)에 running하였습니다.
gel을 nylon membrane에 transfer하기 위해 gel glass에서 분리해보니 gel이 힘없이 찢어지고 너무 견고하지 못해 gel을 membrane에 transfer하기 쉽지 않군요. EMSA 경우에 사용될 5% gel 조성중 이런 문제가 없는 좋은 gel 조성을 아시면 알려주시면 감사하겠습니다.
그리고 gel의 DNA만을 nylon membrane에 옮기고 나서 blocking을 한 후 streptavidin-HRP로 처리후 ECL로 발색을 할 예정입니다. Biotinylated DNA가 transfer되 nylon membrane을 blocking하기 위해선 어떤 blocking buffer를 사용해야하나요? 제가 알기론 casein이 첨가된 PBST로 blocking한다고 보았는대, (-) charge의 DNA가 (+) charge의 nylon에 transfer되었으니, salmon sperm DNA같은 crude DNA로 blocking할 것 같은대 단백질인 casein을 사용한다는 것이 이해가되질 않습니다.