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혹시 구아니딘이 있는 상태가 아닐런지요?
EPO가 박테리아에서는 inclusion body일텐데... 그렇기 때문에 구아니딘으로 녹여 젤을 내린것은 아닌가요? 구아니딘이 있으면 젤이 잘 안내려 갑니다.
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초보석사
(비회원)
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13.11.05 11:26
아 세포는 CHO cell 에서 생산했습니다.
그래서 따로 녹이는 과정 없이 culture media만 웨스턴블랏으로 확인한 것입니다.
ㅜㅜ
EPO는 heavily glycosylated protein이기 때문에 밴드가 원래 브로드 하게 나오는 게 정상입니다.
그 이유로 PNGase F 처리 하신 후 걸어보면 샤프한 밴드를 보실 수 있습니다.
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bluerain97
(비회원)
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13.11.11 12:03
EPO는 세개의 N-glycosylation site를 가지고 있고, 각 glycosylation site 마다 말단에 최고 4개의 sialic acid가 붙을 수 있습니다. 이론적으로 최고 12개의 sialic acid가 붙을 수 있겠죠. 하지만 세포에서 생산을 하다보면 1~12개까지 넓은 범위로 sialic acid가 붙은채 생산이 될 수 있고, 각각 size에 큰 차이를 보이기 때문에 gel에서 보시는것 처럼 넓은 범위에서 broad하게 보이는 것입니다.
정확하게 1 band로 확인하고 싶으시면 단백질을 정제해서 분석을 하시거나, IEF를 걸어서 각 isoform band를 분리해서 확인하시는 것이 좀 더 명확합니다.