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 전체 > Molecular Biology-DNA > Purification/Isolation
조회 4711  스크랩 인쇄하기 주소복사 트위터 공유 페이스북 공유 
질문 DNA extraction 후 purification 과정에서 도와주세요
알kyungsuna  | 2013.10.30 15:18
안녕하세요 DNA 뽑는 것부터 버벅대고 있는데 좀 도와주세요ㅠ

지금 제가 bacterial cell에서 DNA extraction 을 하고 있습니다
일단 제 sample은 양은 적지만 polysaccharide, protein 등이 많은 sample 입니다 

먼저 buffer로 wash step을 많이 하고 (이 과정에서 loss가 많아서 무작정 많이 할 수 만은 없습니다ㅠ 또 많이 한다고 특별히 달라지는 내용은 없습니다. DNA 농도가 떨어지는 것 이외는.)
시중의 lysis buffer를 이용해서 cell lysis를 한 후, 다시 DNA purification을 하고 있습니다
Lysis step 까지하면
Concentration 300~400 ng/ul (20ul elution)
A260/A280 0.7~0.8
A260/A230 0.1~ 입니다

purification은 kit을 이용하다가 DNA loss가 너무 많고(10ng/ul) purity (1.5~1.6)도 그다지 좋지 않아서 manual로 phenol chloroform, EtOH ppt 를 진행하고 있습니다.
(DNA purification kit 이것 저것 써봤습니다. 일반 E.coli DNA로 test해 봤을때 수율이 좋으니 제 실수보다는 sample의 문제인 것 같습니다.)

그런데 phenol(phenol:chloroform 5:1, pH8.0) 처리를 5~6번 정도하고(눈에 안보일때까지) chloroform(pure chloroform) 처리 2번하고 해도 A260/A280 값이 1.5~1.6 입니다.
phenol 2~3번 하고 chloroform 1번 처리해도 A260/A280 값이 1.5~1.6 입니다.
나아지지는 않고 DNA 농도만 떨어집니다.
centrifugation은 13000 rpm 5 min 4도에서 계속 진행하고 있습니다

EtOH ppt 과정에서는 centrifugation 13000 rpm 30 min 4도에서 진행하고 있습니다.
이 과정까지 마치고 나면 
Concentration 60~ng/ul
A260/A280 1.5~1.6
A260/A230 1.8~1.9 입니다

이 과정 후에 real time PCR을 진행하려고 해서, A260/A280 값을 1.8 정도로 올리고 싶은데요
왜 protein contamination 이 계속 생기는 걸까요?
proteinase K 처리는 해봤지만 purity는 더 떨어지기만 합니다ㅠ
DNA purification 과정 좀 도와주세요~
#phenol chloroform
 
#EtOH ppt
 
#DNA purification
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
개구리명품남자  |  2013.10.30   

PCR수행에 있어 purity 1.5정도는 전혀 문제 될게 없습니다.
bacterial chromosome을 prep하시는것 같은데 plasmid에 비해 purity가 다소 떨어질수 있습니다.
전혀 문제 안될것 같네요. plamid인 경우라면 transfection이 목적인 경우 purity에 의해 효율의 차이가 크겠지만 단순히 real-time PCR만을 수행하실거라면 큰 무리 없이 가능할것 같습니다.

알kyungsuna  |  2013.11.01   
답변 감사합니다!
제가 잘 몰라서 그러는데ㅠ
A260/280 1.8~ 과 1.5 정도는 data값이 차이 나지는 않나요?
real-time PCR 할 때 1.5~ 까지는 괜찮은건가요?

--------------------------------------------------
청개구리명품남자 (2013-10-30 21:59)
 답변추천0   

PCR수행에 있어 purity 1.5정도는 전혀 문제 될게 없습니다.
bacterial chromosome을 prep하시는것 같은데 plasmid에 비해 purity가 다소 떨어질수 있습니다.
전혀 문제 안될것 같네요. plamid인 경우라면 transfection이 목적인 경우 purity에 의해 효율의 차이가 크겠지만 단순히 real-time PCR만을 수행하실거라면 큰 무리 없이 가능할것 같습니다.

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