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 전체 > Immunology > Immunoprecipitation
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질문 protein-protein interaction 볼 때 IP 계획중에 여쭤볼게잇습니다..ㅎ
알잉귀미루  | 2013.10.27 21:12
안녕하세요
궁금한게 몇가지 있어서... 좀 여쭤보려고 하는데 괜찮으련지요?ㅎㅎ;

protein-protein interaction을 보려고 하는데
HEK293이 interaction볼 때 가장 자주 사용되고 오버도 잘 되는 cell이라고 하여 사용할 예정이구

IP 하려고 하는데 주위에서 엄청 고생 많이 했다고 들어가지고요 ㅎㅎ
심지어 interaction 보는거는 PTM 보는거 보다 훨빼 예민하다고 하길래 무서워가지고..ㅎ

NP-40 1% lysis 버퍼 사용 하고 있구요(쏠트는 150mM Nacl?? EDTA도 소량 들어가고..)
cell 깰 때 sonication 시키려는데 interaction 볼 때는 요것들이 strong하게 붙어있지 않는한
쏘니케이션 시키면 떨어질수도 있다고 뭐 하더라구요.. 문제없을지요?ㅎ;; -----------1번 질문

그리고 cell 깨서 IP할때 전 S-알드.. 사의 Flag affinity gel 쓰려고 하는데
mouse로 detection 하는거구 요놈이 효율이 좋고 background 나름 깔끔하게 잡힌다고 해서;ㅅ;
어찌됫건.. Flag으로 잡으면 문제가 될 수 도 있다는 것이..
Flag이 워낙 antibody가 잘 잡는 놈이라 IP같은 민감한 실험에 nonspecific을 잘 땡긴다는 소리를 들었는데 요것이 사실인지요..? ---------2번 질문..

그리고,., interaction을 볼 때, mild한 조건, mild mild 하는데,.
너무 mild한 조건으로 실험을 하려다 보니 cell이 잘 안깨질 가능성도 있는지요..?
제가 예전에 좀 harsh한 라이시스 버퍼로 쎌 깰때는 단백질 쪼금만 걸어도 오버된걸 눈에띄게 잘 볼수 있었는데 np-40 시험삼아 약한아이로 쎌 깨니까 같은 양으로도 band가 좀 약하게 보이는 경향이 있더라구요.. endo level에서의 차이는 많이 안났지만 같은 조건에서 overexpression이 많이 약하게 나온다는...
이건 이유가 있어서 그렇게 나오는건지요..? 그냥 궁금해가지고..ㅠ------ 3번 질문..
tubulin이랑 이런걸로 같이 봤을 때 정량에 문제가 없다 봤는데 이거 ECL 처리시간이나 flim 현상시 찍는 시간 요런것들로도 차이가 심하다고 해서..(육안으로 확인하려다 보니..)


그리구.. protein - protein 인터렉션 볼때 주로 co IP, GST pull down 등등 하시는데 GST는 비추하시는 분들이 많더라고요..ㅎ;
단백-단백 규명 실험에서 잘 봐오셨던 분들 계시면
혹시나 큰 그림으로 메쏘드 맛배기만 보여주실수 있으련지요??;ㅅ;

말이 너무 길어져서 읽기 귀찮으시겠지만..  답변 감사히 기다리겟습니다
#IP
 
#protein-protein interaction
 
#Immunoprecipitation
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
개구리바보에게바보가  |  2013.10.27   
1. 글쎄요, sonication 때문에 protein-protein interaction이 깨진다는 얘기는 처음 들어보네요. 저도 co-IP 많이 해봤지만 항상 sonication으로 cell 깼고, 아무 문제 없었거든요.

2. M2 affinity gel 말씀하시는 것 같은데 이거 괜찮습니다. 잡밴드야 western condition으로 조절하시면 되고요. non-specific binding이야 어떤 epitope을 쓰던 딸려오는건 마찬가지인데, IP해서 mass를 한다거나 그런 정교한 실험이 아니라 그냥 co-IP하시는거면 크게 신경 안쓰셔도 될 것 가네요.

3. 아무래도 mild한 detergent를 쓰면 extraction되는 protein 양도 조금 줄어들겠죠. 근데 co-IP는 antibody를 사용하는거니 harsh한 조성을 주기가 힘들죠. M2 affinity gel의 data sheet 보면 compatible한 agent들의 농도 범위가 나와있으니 참고하시구요..

GST는 안써봐서 pass.. 메쏘드는 뭐 별것도 없습니다. endogenous protein을 IP해서 endogenous interaction partner를 보는거야 조금 까다롭긴 하겠지만, FLAG붙이고 overexpression해서 거기에 딸려오는 단백질 보는건 앞에 IP 과정만 빼면 웨스턴이랑 똑같고요.. 저는 binding 2시간 시키고 적당한 washing buffer로 4-8번 washing해준 후 beads에 4x loading buffer를 섞어주고 로딩합니다. washing buffer는 보통 lysis buffer에 NP-40이나 triton x-100같은 mild detergent를 0.1%정도 넣어준 거고요. Lysis buffer에는 따로 detergent 넣지 않고 그냥 sonication으로 셀 깨버립니다.

물론 뭐 단백질은 케이스 바이 케이스가 많으니 처음에 pilot 실험으로 여러 조건을 테스트해보시는 걸 권장합니다.
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