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 전체 > Cell Biology > Cell Culture
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질문 HEK 293 cell 컬쳐방법 질문드립니다.
올챙이스카츠무  | 2013.10.07 14:09
안녕하세요,

저는 이번에 HEK 293 cell line을 처음 분양받아 배양하려 하는 대학원 생입니다.
저희 랩은 기존에 293FT cell(Invitrogen사 제품)만 배양했었고 HEK 293 cell은 처음입니다. 
한국세포주은행에서 분양받기로 한 상태이며 그에 따라 배양을 위해 필요한 배지와 프로토콜을 정리하고 있는데 참고하려는 레퍼런스마다 배지조성이나 여러 가지 사항이 다른 점이 많아 이렇게 문의드립니다.
주로 한국세포주은행 사이트에서 추천하는 방법과 ATCC에서 추천하는 방법을 토대로 질문드립니다.
[1] 성분 관련
1) FBS
- 저희는 Gibco사의 FBS를 가지고 있습니다. 한국세포주은행에서는 heat-inactivation한 것으로 넣으라고 하고, ATCC에서는 heat-inactivation하라는 말이 없습니다. 업체 학술팀에서는 heat-inactivation한 것과 안 한 것이 실제로 큰 차이가 없다라고는 하는데 이런 경우에는 어떤 방법을 써야 하나요?
2) antibiotics
- 보통 293FT cell 키울 때는 Pen/Strep(5000U/ml 제품) 을 10% 넣어서 사용했었습니다. 한국세포주은행에 문의한 바로는 Unit에 대한 설명 없이 pen/strep을 1.1% 넣어서 사용 하라고 하고 있으며 ATCC의 프로토콜에는 항생제에 대한 언급이 없습니다. 
3) Filter sterilization
- 기존에 293FT cell 키울 때 complete DMEM 만들 때도 filter sterilization을 항상 해서 사용했었습니다. 하지만 이번에 한구세포주은행에 문의한 바로는 MEM+HEPES+NaHCO3까지 넣은 후 filter를 하고 그 후에 pen/strep과 heat-inactivated FBS를 넣으라고 하더군요. 보통 필요한 성분들을 모두 다 넣은 후에 filter sterilization하지 않나요?


[2] subculturing 방법 관련
- 사실 저는 293FT의 subculturing방법과 동일 할 것이라 생각했는데 지금 BRIC에 올라온 글들을 보니 프로토콜이 좀 다른 것 같습니다.
1) PBS washing
- 293FT 를 키울 때는 media suction하고 바로 trypsin/EDTA 쳐서 cell detach시킨 후에 centrifuge돌려서 cell 가라앉히고 trypsin/edta가 포함된 media를 discard한 후에 새로운 complete DMEM넣어서 pellet을 pipetting해준 후에 새로운 flask에 분주했었습니다.
- 일단 왜 HEK293cell은 PBS로 washing을 왜 해야 하나요? 
2) cell plate coating 필요여부
- 어떤 글에 대한 댓글을 보니 HEK 293 cell은 PBS로 washing 하거나 약간의 충격만 줘도 매우 잘 떨어지기 때문에 flask를 PLL등으로 코팅해서 쓴다고 하는 말이 있는데 정말 그런가요?
3) subculturing 빈도
- 제가 기존에 키우던 293FT cell은 굉장히 빨리 자라기 때문에 보통 24~48시간 사이에 1:3으로 split해서 subculturing을 해줘야만 했습니다. 물론 그렇기 때문에 중간에 media change는 할 필요가 없었구요.
- HEK293 cell을 T75 flask에 키울 경우 보통 얼마나 자주 subculturing 혹은 media change를 하시나요? 물론 자세한 것은 제가 실험하면서 찾아가야 하겠지만 일반적으로 어떻게 하시는지 궁금합니다.

이상입니다!!! 새로운 cell을 키우려다 보니 궁금한 점이 많아서... 두서 없이 주저리주저리 적었네요 ㅠㅠ 고수님들의 답변 기다리겠습니다. 감사합니다!!!! 
#HEK293
 
#subculturing
 
#HEK 293 cell
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대학원생  |  2013.10.07    

제가 293FT랑 HEK 293 둘다 키워봤는데
culture 할 때 크게 다르지 않습니다.
전 둘다 동일한 조건에서 키웠습니다.
293FT도 잘 떨어지지 않나요??
PBS washing 한 후에 trypsin 처리 하는게 원래 정석입니다.
293FT가 워낙 잘 떨어지니 그냥 처리 하신 것 같네요.
293 시리즈가 subculture 할 때 비슷비슷해요..

개구리오크남  |  2013.10.08   

PBS washing 과정은 모든 cell에 적용되는 과정입니다. serum 성분이 T/E를 inhibition 할 수 있기 때문에 원래 PBS로 serum을 다 제거 한뒤 T/E를 처리하는게 맞지만, 293 같이 잘 떨어지는 cell은 PBS washing과정에서 떨어질 수 있기 때문에 저는 따로 wash는 안 해줘요.
저희는 따로 coating된 dish를 쓰지 않구요, 저희 293은 doubling time이 대략 24시간 정도 되더라고요. subculture 빈도는 passage따라서 조금 차이가 날 수 있으니, 실험자분이 경험으로 맞추시면 될 거 같아요.

개구리바보에게바보가  |  2013.10.08   

[1]
1) 실제로 큰 차이가 없습니다. Gibco꺼 그냥 쓰시면 됩니다.
2) 항생제 넣고 키워본적이 없어서 이건 패스.. 사실 조금만 조심하시면 컬처할때 항생제 굳이 쓸 필요 없습니다.
3) 배지를 만들어서 사용하시나요? 저는 FBS는 필터 따로 안하고 새 배지 뚜껑 열때 그냥 넣고 씁니다.

[2]
1) trypsin 처리할땐 PBS로 와싱 해주는게 정석입니다. serum이 trypsin의 작용을 저해하거든요.
2) 293 시리즈가 잘 떨어지긴 하지만 굳이 코팅까지 할 정도는 아닙니다. 뭐 이거는 취향따라..
3) 293 시리즈는 전반적으로 빨리 자라는 편에 속합니다만 batch마다 다르니 한번 테스트를 해보시는게 좋을것 같네요. 근데 FT랑 비슷할듯요 (FT를 키워본적이 없어서)

결론은 잘 자라는 셀이니 너무 크게 걱정하지 마시고 한번 하던대로 해 보시길..

올챙이스카츠무  |  2013.10.08   
답변 정말 감사합니다!! 많은 도움이 되고 있습니다.

정리하면,

1) PBS 워싱은 필요하지만 그것이 cell을 심하게 떨어트릴 경우 패스해도 된다.
2) FBS는 heat-inactivation여부와 상관없다.
3) 항생제를 굳이 안써도 된다.
4) 코팅은 대체로 필요없다.
5) cell은 293FT 만큼 잘 자랄수도 있다. (한국세포주은행에서는 2~3일에 한번 배지교환하고 80% 차면 subculturing하라고 하시더라구용 ㅎㅎ)


잘알겠습니당 ㅎㅎ 추가질문 드립니다!!
1) PBS는 autoclave한 것으로 사용하면 되나요?
2) Media의 경우 한국세포주은행에서 알려주신 대로 (MEM powder + 3차 증류수 + HEPES + NaHCo3 => filter한 뒤에 penstrep 과 FBS넣어 사용) 사용할 생각이지만 많은 분들이 서로 다른 조성의 배지를 사용하고 계신 것 같아서 그냥 한번 여쭤 볼게요. 어떤 배지 사서 쓰시나요? 만들어 쓰시나요? 아님 사용하시는 제품 Cat. No. 가 있나요? ㅎㅎ 

이상입니다 ㅋㅋ 감사해요!! 

개구리바보에게바보가  |  2013.10.08   
1) PBS는 오토해서 사용하시면 되니다.
2) 웰진의 DMEM high glucose 사용하고 있는데 여태껏 큰 문제는 없었습니다. 근데 293이야 워낙 잘 자라니 기존에 만들어쓰시던거면 그냥 만든 배지를 쓰셔도 크게 무리가 없지 않을까 싶네요.
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