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질문 pET32a 벡터의 his tag을 이용한 purification
대학원생  |  2013.10.02 10:01
답변있는 질문은 수정/삭제 불가(☞문의)
pET32a를 사용해서 재조합 단백질을 만들예정입니다.
Tag은 his tag을 사용하려고 하는데 N, C-terminal에 모두 his tag이 있습니다.
저는 frame을 잘 맞추어서 C-terminal의 his tag만을 사용하고 싶습니다. N-termina 쪽에 trx가 있는데 enterokinase를 사용해서 잘라낼 것이라...
어떤 방법이 있을까요?
지금 고민은 his tag이 두 개 모두 살아 있어서 pufication시 trx와 목적 단백질이 모두 purification될 것 같네요..
#pet32
 
#his tag
 
#enterokinase
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음,  |  2013.10.02    
벡터 시퀀스 보니까 NdeI으로 자르면 TRX 날릴 수 있겠네요.

null vector NdeI으로 잘라 trx제거 후 이어 붙인 후 님꺼 클로닝 해서 쓰세요.
대왕개구리안재진  |  2013.10.02   

primer 제작시 enzyme site 넣어 PCR을 하시죠?
그렇다면
pimer forward쪽을  MscI-enterokinas site-target gene 이렇게 만들고
pET32 vector에 MscI / XhoI cut으로 insert를 넣으면 되겠네요

대학원생  |  2013.10.02    

답변 감사합니다.
위 방법대로 벡터 염기서열을 변형하여 진행해도 될 것같네요.
그리고 한가지 질문이 더 있는데..
1. 다른 연구자분들도 위 처럼 벡터를 변형시켜서 사용하나요?.
2. 저는 Trx 영역을 제거하고 목적 단백질-his 만 사용하고 싶은데...
제가 이  영역은 처음이라..

대왕개구리안재진  |  2013.10.02   

벡터 수정은 많이들 하는 부분입니다.
그리고 target gene-His tag 이렇게 가려면 pET21 vector가 편합니다.

대왕개구리안재진  |  2013.10.02   
그리고 pET32 의 경우 NdeI는 vector내에 2개가 존재합니다.
선택하면 클로닝이 좀 어려워집니다.
대학원생  |  2013.10.02    
아...많은 분들이 하시는군요
pET21의 경우 Trx가 없어서..
저는 Trx가 disulfide bond형성에 중요한 역할을 한다고 해서...
실험에 쓰는 peptide가 cys이 많아서 말입니다.
그래서 Trx발현은 시키고 마지막에 cut한 다음 목적 peptide만 쓸려는 전략입니다.
답변 너무너무 감사하네요..
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