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 전체 > Molecular Biology-DNA > PCR/RT-PCR/Q-PCR
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질문 PCR시 프라이머 제작 팁이 있나요?ㅠㅠ
PCR은 날 미워해  |  2013.08.02 16:43
답변있는 질문은 수정/삭제 불가(☞문의)

template으로 lambda DNA를 쓰는데요 크기가 48kbp 정도 됩니다
그 중에 일부 크기를 복제하려고 합니다
product size는 20kbp됩니다

유전자의 어떤 부분의 증폭이 필요한 것이 아니라
단순하게 그냥 그 길이의 DNA가 필요해서 PCR을 하는 경우에요

그 정도의 PCR도 가능한 시약을 구매하여 사용하고 있는데
20kbp 보다 한참 작은 사이즈의 단일밴드가 자꾸 나옵니다 약...1kbp 정도?
여러 조건을 바꾸어 봐도 단일밴드와 product 크기에는 변함이 없어요ㅠㅠ

primer 제작할 땐 20kbp 크기를 복제하는 primer set으로 골라서 주문 제작 했는데 말이에요
primer 문제인가 하고 다시 제작했는데...
그건 상황이 더 안좋아요 3개의 밴드가 뜹니다ㅠㅠ

primer는 모두 20mer로 제작했는데요- 
혹시 긴 product를 원하면 프라이머도 더 길게 제작해야한다거나...
GC 함량을 높여야 한다거나 그런 팁이 있을까요?

PCR 고수님들의 답변 부탁드려요~~ 우앙

#프라이머
 
#PCR
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개구리genyx  |  2013.08.02   
Extension time을 kb당 얼마씩 주셨나요? Primer의 specificity가 떨어지는 감도 있고 30mer 이상 늘리는것도 고려해 보세요. 20kb면 상당히 긴데 20mer로 single band를 잡는다는게 무리일 수도 있다는 생각이 드네요. 20kb안에 유사 시퀀스가 있어서 짧게 나오는걸 수도 있으니까요. Total running time은 몇시간 걸리시나요. 아침에 와서 돌리면 오후에 끝날 듯 싶은데요. dNTP나 taq도 많이 넣어 주셔야 하고요. 그리고 20kb 정도의 PCR은 incremental cycle protocol을 사용합니다. 예를 들어 extention time이 30sec/kb일 때(20kb면 총 10분이죠) 10cycle까지는 이조건으로 하다가 11cycle 부터는 30sec/kb 에 20sec씩 incremental하게 증가시키는거죠. 다시 말해 11cycle에서는 30sec/kb (10분)+20sec이고 12cycle 에서는 30sec/kb(10분)+40sec 이런 식으로 마지막cycle까지요.
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