|
| 전체 > Molecular Biology-Protein > Western Blot Analysis |
|
 |
|
|
 |
SDS-PAGE 에서 sample을 well에 주입시 sample이 가라앉지 않습니다. |
|
|
 아화 | 2013.07.18 11:30 |
|
안녕하세요.
Western blot을 하기위해 SDS-PAGE를 하고 있습니다.
그런데 gel을 electrophoresis kit에 설치하고 running buffer에 담궈준 다음에 sample loading을 하려는데 sample이 well 내로 가라앉지 않고 위로 떠서 running buffer와 섞여서 사라져버립니다.
Running buffer는 10X Running buffer(glycine 144g, tris-base 30.30g, SDS 10g, pH 8.3, total 1000ml)로 실험실에서 직접 만들어 사용합니다.
Sample loading buffer는 biosesang(바이오세상)의 5X SDS-PAGE loading buffer를 사용합니다. 조성은 1M tris-HCl pH 6.8, 0.5M DTT, 10% SDS, 0.5% bromophenol blue, 50% glycerol 입니다.
Sample을 만들때 8㎕ D.W, 2㎕ protein, 2.5㎕ loading buffer의 구성으로 만들어 사용하는데요.
Marker는 BIO-Rad의 것을 사용하는데요, marker도 loading시 초반에는 침전되었다가 후에 buffer에 희석되어 사라집니다.
Sample loading전에 sample을 boiling 후에 spindown하여 ice cooling하고 사용하는데요. 얼마전에 했을때에는 침전이 잘 되서 방법에는 문제가 없다고 생각합니다.
이런 경우 문제는 runnig buffer에 있다고 생각하는 것이 맞을까요?
사실 여러번 시도하여 계속 sample이 가라앉지 않아서 running buffer도 계속 새로 만들어 사용해보았습니다. 그런데도 여전히 sample은 둥둥 뜹니다.
아 그리고 gel을 stacking gel 까지 다 굳히고서 bubble이나 이물질을 없애주기 위해 well 위로 D.W로 세척을 해주었습니다.
그 위로 running buffer를 넣어주어서 loading 준비를 했습니다.
주절주절 말이 많아서 산만하네요.
결론은 sample이 well에 제대로 침전되지 않고 뜨는 이유가 무엇인가 입니다.
의심되는 점은 1. gel 세척시 well 위로 들어간 D.W / 2. running buffer의 문제 / 3. sample loading buffer의 문제 / 4. sample 제작 과정의 문제 입니다.
피드백을 계속 해봐도 같은 실패로 이어져서 골머리가 아프네요.
제가 혹여나 놓치고 있는 점이나, 문제점을 아시는 분 간곡히 조언 부탁드립니다.
|
|
#SDS-PAGE #sample loading buffer #loading buffer |
답변하기 |
|
|
|
|
|
|
|
|
| |
|
 |
본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다. |
|
|
|
|
|
|
|
|
저도 이런적이 있었는데요... 일단은 10xrunning buffer를 쓴다고 하셨는데 이거 쓰실때 1x로 희석해서 쓰셨나요??? buffer의 농도가 너무 높으면 sample이 가라앉지 않고 떠있는 상태가 되어서 실험을 할수가 없습니다.
그러니까 10xrunning buffer를 1x로 희석해서 사용하세요.... |
|
|
|
 엘피스 | 2013.07.18
|
|
|
|
|
저도 같은 생각입니다.
실제 10x buffer를 그대로 쓰는 사람을 본적도 있습니다. |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Sample 이 가라앉지 않는 이유는 Sample 밀도가 buffer보다 낮아서 인데, 윗분 처럼 running buffer가 정확하게 1x가 되지 않아 running buffer의 밀도가 높아서 일수도 있고, 아니면 sample loading dye 에 문제가 있어 (glycerol 농도 문제) 잘 가라앉지 않을 수도 있습니다. 실험하기 전에, 1.5ml tube에다 1x running buffer 1ml 넣고, 1x sample dye를 loading 하였을 때 잘 가라앉는지 관찰해 보시고, 만약 잘 가라앉지 않는다면, 2x 로 농도를 높이거나 sample dye를 직접 만드는 것이 나을것 같습니다. |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
 |
|
 |
 강시
SPEED
 실험조아
 enen
나는야학부생
Choip
친절하게살자
새슬
|
|
|
안재진
 느림보
Kim
propadrum
얕은지식
엘피스
안재진
달려라~
|
|
|
|
|
|
실전 실험 프로토콜 101
랩노트
