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Agarose gel에서 10ug RNA는 충분하지 않은 양이긴 하지만 그렇다고 전혀 않보이지 않는 양도 아닙니다 (작은 gel이면 10ug 큰 gel에서 20ug이상을 loading해야 합니다). 문제는 gel을 염색해서 보는 방법을 사용했다고 하면 증류수로 수차례 흔들어 주면 destaining해야 합니다. 염색이 확실해야 RNA의 상태를 확실히 진단할 수 있습니다.
protocol의 ml은 잘못된 표기죠? ul가 되어야 합니다.
BPB가 포함된 tracking dye가 표시되지 않은 점을 빼고는 문제없는 조성입니다. Heating을 하는 것도 정상입니다. 단지 염색이 명확하지 않고 사진의 상태가 좋지 않는 점이 문제입니다.
엘피스님..
mRNA 양이.. 어떤분은 1~2 μg 만 들어가도 충분한 양이라고 그러시던데..
그래서 제가 너무 많이 loading 해서 스미어하게 나온건가 했거든요.
rRNA 는 많이 넣지만, mRNA 는 저정도 넣어도 충분하다던데.. 뭐가 맞는건가요?
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레벨5
ExDown's
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13.05.27 16:19
FA/FAH buffer를 이용하신것 같은데요, RNA prep은 워낙 sensitive 해서
smear 하게 나오는 경우도 많습니다.
깔끔하게 band 로 나오면 좋겠지만 다시 prep할 상황이 안되고
real-time pcr 사용할 것이 아니라면 cDNA 합성후 pcr로 한번 확인해보시는게 어떨지 싶습니다.
아니 mRNA를 10ug loading한 것이라구요????
10ug의 mRNA를 얻을려면 1mg정도의 total RNA로부터 시작해야 하는데, 이를 d(T) resin으로 모두 정제했단 얘기인가요?
DNA 1ug과 RNA 1ug은 염색되는 정도가 다릅니다. RNA는 single stranded polynucleotide이며 EtBr의 염색정도가 1/5수준밖에는 되질 않습니다. 더군다나 대부분이 rRNA (18S, 28S)이기 때문에 전체적인 pattern 특히 degradation여부까지를 보기 위해서는 10ug이상을 loading해서 선명히 모든 것을 볼 수 있습니다.
물론 1ug만 걸어서도 확인할 수 있습니다. 좀 작은 gel에 두께가 얇고, loading volume이 적은 comb를 쓰면 되고, EtBr보다 민감한 염색 dye를 쓰면 됩니다. 하지만 formaldehyde를 이용하는 denaturing gel에서는 일반 agarose gel에서 보다 염색감도가 또한 떨어집니다.
Total RNA는 mRNA + rRNA + tRNA의 mix입니다. mRNA라고 하는 것은 polyA tail을 갖는 messenger RNA를 의미합니다. 확인해 보세요.
모두 너무 감사드려요~!
조언 덕분에 깨끗한 결과를 얻었어요 ^0^