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 전체 > Molecular Biology-DNA > Purification/Isolation
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질문 plasmid DNA 전기영동 실험 도와주세요ㅜㅜ
알박지서울  |  2013.05.17 23:27
첨부파일 파일첨부: 1.jpg (5 KB)
이미지 첨부파일
plasmid DNA 전기영동 실험 관련해서 질문드립니다

일단 pcDNA 3.1로 실험해서 전체 길이는 약 5.5kb, insert DNA 길이는 약 2kb 정도 되는 걸 사용했고
제한효소는 EcoRI랑 XbaI를 사용했습니다 사용한 pcDNA 3.1에 각각 1개씩의 절단부위를 가지고 있다고 확인했습니다

각각 처리해주고 실험했는데 사진에서 맨 왼쪽 lane부터 nocut, double cut, XbaI 처리 single cut, EcoRI 처리 single cut, 그리고 1kb DNA ladder입니다

실험 관련 기초 지식이 부족해서 결과를 분석하는데 애를 먹고 있네요ㅜㅜ 검색해서 어느정도 생각해낸것은
제한효소를 처리하지 않은 lane에서는 맨 위쪽 band는 재조합된 plasmid DNA-대략 8kb, 그 아래는 첨가되지 않은 plasmid DNA-대략 5~6kb라고 생각했고요
둘 다 처리한 lane에는 맨 위쪽은 역시 잘리지 않은 재조합된 plasmid DNA-대략 8kb, 그 아래는 효소에 의해 잘린 DNA-대략 5~6kb, 맨 아래 희미하게 보이는 band는 insert DNA-대략 2kb라고 생각했습니다
그리고 XbaI만 처리한 실험군에서는 1번 lane과 같다고 판단했는데 문제는 4번 lane-EcoRI만 처리한 lane입니다ㅜㅜ 3번 lane과 같은 결과가 나와야 한다고 생각했는데 가장 위에 8kb 부근의 band 하나만 관찰이 됩니다. 왜이렇게 나올까요?ㅜ
각각 band가 두꺼운건 supercoiled, linear, nicked DNA가 겹쳐서 넓게 나온것으로 생각했습니다. 1% agarose gel을 사용하였는데 그러면 겹쳐서 나온다는 말을 들은 것 같네요

4번 lane을 제외하고도 일단 위에 제가 분석한게 맞는지부터 잘 모르겠네요ㅜㅜ 공부한다고 찾아봤는데 도저히 해결되지 않는 부분이 있어서 질문드립니다ㅜ 실험을 다시 해야될까요?ㅜㅜㅜㅜ

#전기영동
 
#plasmid DNA
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
개구리유전학도^^v  |  2013.05.18   

Genomics하는 실험실 사람입니다.

우선 prep.한 DNA를 agarose gel에 그것만 달려 보세요.

1% 정도면 8kb라고 해도 충분히 separation됩니다.

지금 사진 해상도가 많이 낮고, DNA ladder의 각 band size가 확인이 안 되긴 합니다만,

plasmid DNA를 그냥 달리면 보통 2개 band가 보이는데요,

그건 별로 안 중요합니다.

EcoRI과 XbaI으로 single cut 했을 때,

DNA가 모두 digestion 됐다면 single band가 뜹니다.

vector와 insert에서 EcoRI과 XbaI recognition site가 1개씩 있는 게 맞다면,

위 내용은 분석할 필요가 없어 보입니다.

일정한 패턴이 나오질 않습니다.

각 lane에 loading 한 DNA가 바뀌었다면 모르겠습니다.

아무튼 DNA 확인 후, 다시 cut 해 보시길 바랍니다.

Cut이 잘 안 된다면 total volume을 늘려 보세요.

DNA가 동일하고, 일정한 농도를 가지고 있다면, 

보통 size가 큰 band가 더 강하게 나옵니다.

이럴 경우, 아마도 다른 DNA의 오염이나 실험적인 오류가 있었을 것이라 생각됩니다.

대왕개구리엘피스  |  2013.05.18   
XbaI에 문제가 있어 보입니다. 활성이 아주 없지는 않지만 아주 약합니다.
XbaI site가 있는 다른 DNA를 가지고 활성이 정상적인지 test를 해보세요 (가능하면 site가 두개라서 two band가 나오는 DNA면 더 좋습니다).
EcoRI은 정상입니다.

1% gel에서 8kbp, 5kbp, 2kbp를 보는 것은 무리가 있습니다.
0.7% gel을 사용하세요..
알박지서울  |  2013.05.18   
두분다 답변 너무 감사합니다^^
우선 실험 다시 한번 더 해보고 XbaI도 한번더 확인해보려고요ㅎㅎ
정말 많이 도움이 되었네요ㅋㅋ이 실험에 대해서도 좀 더 알게 된거 같아요ㅎㅎㅎㅎ
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