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 전체 > Molecular Biology-Protein > Pull-down Assays
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질문 Co-IP 후 washing
bio  |  2013.05.12 01:29
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binding partner를 찾고자 co-IP를 하였습니다..
처음 계획은 LC-MS/MS를 이용해서 binding partner를 찾고자 함이었거든요..
그래서 IP후에 washing은 PBS 로만 해주었습니다.
그런데 elution후에 gel을 걸어보니 거의 lysate를 loading 한거 만큼 여러 단백질이 보이네요..
non-speciifc binding을 줄여야 할거 같은데요..
어떤 washing buffer가 좋을까요?
감사합니다...

#IP
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
hopkins  |  2013.05.12    

처음 셀에서 lysate만드실때 사용하신 lysis buffer가 무엇인가요? 그 buffer로 washing하시면 될 듯 합니다. detergent는 complex 가 disrupt되지 않게 하기 위해서 ~1% NP-40 이나 Triton이 들어가면 될 듯 합니다.

대왕개구리엘피스  |  2013.05.12   
첫번째 문제는 antibody의 quality가 낮은 듯 보인다는 것입니다.
좀더 특이성이 좋은 antibody의 사용을 생각해 봐야 합니다.

protein/protein interaction (이경우는 항원/항체)에 영향을 주는 요인은 pH, salt conc. detergent 등 다양합니다. PBS가 보편적인 buffer이지만 in vivo를 정확히 재연할 수는 없습니다. 하지만 다른 대안이 없기 때문에 가변적으로 적용해 볼 수 있는 것은 detergent의 농도와 종류입니다. NP-40, Triton X-100, Tween20과 같은 non-ionic detergent는 protein interaction을 약하게 해주는 활성이 있어 non-specific binding을 제거해 주는 목적으로 사용됩니다. 0.1-1%의 농도대로 extract (binding buffer)와 wash buffer에 첨가해 주면 됩니다.

Wash는 오래 또는 많이 하면 할 수록 좋습니다.

 하지만 항체의 특이성이 떨어진다면 이역시 좋은 해결책은 아니며 단순히 background 조금 줄여주는 효과밖에는 없습니다.
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