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BioLab 박소정 교수
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 전체 > Cell Biology > Cell Culture
조회 15408  스크랩 인쇄하기 주소복사 트위터 공유 페이스북 공유 
질문 cell contamination 때문에 질문드립니다.
ㅠㅠ  | 2013.05.02 22:12
답변있는 질문은 수정/삭제 불가(☞문의)
안녕하세요

cell culture 이제 두달 된 초보입니다.

그런데 자꾸만 cell들이 contam되어 힘이 듭니다..

처음에는 초보니까 그럴 수 있지 다음에 조심해서 해야지 했는데.

점점 시간이 지나도 나아지지 않고 계속해서 contam 문제가 발생하고 있어

요즘 스트레스가 이만저만이 아닙니다 ㅠㅠㅠㅠㅠㅠ

cell contamination에 대해서 여러 자료를 찾아보고 clean bench내에서 실험할때 주의사항을

여러 숙련된 선생님들과 자료를 통해서 보고 듣고 배워서 그대로 한다고 하는데 오염이 되네요.

주로 오염되는 것들은 bacteria 종류로 보여집니다.

제가 clean bench 사용하기전 uv램프를 끄고 팬? 시스템을 켠 후 형광등을 켭니다.
그리고 70%알콜로 닦아낸 후
팁통, tube, vial, dish, media 등등 필요한 재료를 70%알콜 소독 후 넣어 사용합니다.
물론 실험직전에 라텍스장갑낀 손도 70%알콜 소독하구요.

pipet이나 팁등 cell이나 media가 직접 닿는 부분들이 다른 곳에 닿였을 경우 버리고
새것으로 바꿔사용합니다.

다만 contam 원인으로 의심되는 것은 제가 실험할때 clean bench 유리문에 팔이든 머리든
가끔 쿵 박을때가 있습니다. 그때 clean bench내 현미경이나 다른 것에 있던 먼지가 날려서
오염이될 수도 있을까요?

아니면 실험할때 방진 마스크를 사용하긴 하는데 마스크내에서 입을 벌리고 사용하면
혹시 오염이 될 수도 있을까요?ㅠ 좀 이상한 질문이긴 합니다만.... 어쨌든 그만큼 다양한
방면으로 contam원인에 대해서 오만가지 생각이 드는 요즘입니다.

아니면 MEF Medium이 진한 자주색으로 변하면 pH가 염기로 바뀐거라고 하던데
이것의 변화와도 오염이 관계가 있을까요?
처음에 MEF Medium을 만들었을때는 투명한 다홍빛처럼 색이 나는데
점점 사용할 수록 색이 진해지더니 진한 자주색으로 색이 변합니다.
Medium이 염기로 변해서 contam이 잘 되는 걸까요.
아니면 Medium이 contam이 되어서 염기성으로 변하는 걸까요.

그리고 medium을 냉장고에서 꺼내서 37도 water bath에 warming시키면
tube나 medium이 든 통 내부에 물방울들이 맺히는데 그런 곳에서도 contam될 가능성이
있을까요?

일단 medium의 문제인지 확인하기 위해서
60파이 디쉬에 MEF Medium, ES Medium, 그리고 혹여 transfer할때 사용하는
DMEM/F12 + Collagenase가 문제 일까 싶어 5ml씩 넣고 incubating 시켜놨습니다.
그러나 근본적인 문제는 실험을 하는 저의 문제인 듯합니다.

제가 있는 연구소에서 이때까지 여러사람을 봐왔지만 저는 다른 사람들보다 contam을
많이 일으킨다고 하십니다.
이렇게 계속해서 contam이 나는 것은 분명 저에게 문제가 있는 듯 한데,
실험하는 저는 정작 어디가 문제가 되는 건지 감 조차 오지 않습니다.
앞으로 제 업무가 주로 iPS/ES cells을 maintaing하고 cell 공급하는 역할 인데
contam문제가 해결되지 않으면 저는 실험실을 나와야 하겠지요.. ㅠㅠㅠㅠ

cell culture가 이리 힘들다니...
다른 cell culture하시는 분들은 어떠신지요?
초반에 겪었던 경험들과, contam을 줄일 수 있는 방법 알려주세요.ㅠㅠㅠㅠ
#contam
 
#contamination
 
#cell culture
답변하기
답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
Micoplasma  |  2013.05.02    
cell culture 에 있어서 minor contem(미약하지만 어느정도의 오염)은 대게 존재합니다. 여기서 어떻게 셀들을 건강하게 유지하는가에 cell culture의 경험이 있다 하겠습니다.

오염원이 뭐 여러가지가 있겠지만 이미 보관해 놓은 셀들이 본래부터 오염된상태였을수도 있구요 미디엄의 박테리아 오염이 의심되신다면 셀없이 미디엄만 인큐베이터 몇일 넣어보시고 오염물이 미디엄안에 산재하는지 확인하시면 되겠네요. 그리고 미디엄을 한번에 500 ml정도 쓰시지 않는한 매번 50 ml Falcon tube등에 나누어서 water bath하시면 본래 stock medium의 pH 변화로 인한 미디엄 색변화를 막을수 있겠어요.

자세히 어떤 contam인지 알수가 없어서 여기까지만 적습니다.
개구리secu  |  2013.05.02   
그럴 경우 가장 먼저 의심해야 하는 것은 클린벤치 입니다. 클린벤치의 HEPA 필터를 언제 교환했는지 확인하시고 입자 계수기 를 사용해서 얼마나 청정하게 제대로 유지되는지 확인하시길 바랍니다.

알콜로 닦는 것은 필요하기는 하지만 어느정도 깨끗하다고 하면 사실 생각보다는 큰 영향을 미치지 않습니다. 그리고 UV는 사실 켜 놓으나 마나입니다. 일부 사람들은 안 켜놓으면 마치 오염된다고 착각하는데, 가장 쓸데 없는 것이 UV 켜놓는 것입니다. 왜냐하면 UV는 균의 한층만 죽일 수 있고 그 바로 아래층도 죽이지 못합니다. 그러니까 UV는 신뢰하면 안되고 또한 UV는 눈에 보이는 것이 아니라 얼마만큰 나오는지 모릅니다.

분명한 것은 멸균기를 믿을 수 없다면 일단 일회용품으로 다 교환하시고, 그 다음은 일단 오염되면 오염될 때 사용된 배지등은 모두 다 버리거나 재필터 해야 하고, 일단 가능하면 깨끗한 상황으로 만들어 놓은 다음에 하나 하나 검사해 보세요.

사실 유리문을 쿵 하고 부딛치는 것은 굉장히 위험한 행동같습니다. 이런 것 확인하시고 싶다면, 우선 클린벤치 안에 디쉬에 배지 넣고 쿵 쳐보세요.. 그렇게 몇번 한곳을 배양해서 오염되면 심각한 것이죠..

그리고 클린벤치는 사용하기 전에 반드시 30분간 켜놓는 것이 원칙입니다. 일부 회사는 아침에 켜놓으면 집에 갈때까지 아예 끄지를 못하게 해요. 보통 5분이면 된다고 하지만 제 생각엔 15분은 켜놓아야 하고.. 그리고 클린벤치 안에서는 동작이 빠르면 lamina flow가 깨지기 때문에 위험하니까, 동작은 좀 느린 게 좋습니다.

그리고 원칙적으로는 클린 벤치 내에서는 알콜램프는 사용하지 않아야 lamina flow가 유지되어서 제대로 작용합니다만, 일부 사람들은 알콜램프를 사용하는데 만약 사용할 경우 시간을 최소화해야 합니다.
개구리meanglae  |  2013.05.03   

일단....마음의 고생이 많겠군요...

제가 여러 학생들을 교육을 시켜 본 결과, cell culture는 약 3개월 정도가 지나면 오염도 잘 시키지 않으며...실험도 믿을만한 결과를 도출을 해 내더군요...

일단 제가 보기에는 첫번째 cell culture의 오염원은 손입니다....glove 확실하게 끼시고, 옷등에 묻어 있는 세균들도 오염원으로 작용할 수 있으니까...주의 하시구요...

두번째로는 헤파필터 문제가 클 것으로 예상됩니다. 그런데, 항상 cell culture 만 하던 clean bench에서는 헤파필터를 오랫동안 갈지 않아도 오염이 큰 것 같지는 않더군요...

아무튼, 손이랑 헤파필터가 가장 큰 오염원으로 예상되는군요.....

그럼, 수고하세요.

도너츠  |  2013.05.03    

인큐베이터가 오염이 되었어도 다 컨탐됩니다. 한칸에 오염되면 다른칸으로 번집니다.
클린벤치는 안에있는공기가 밖으로 나오는거라도 최대한 팔만 들어갈 정도로 내리고 실험하셔야 합니다. 
옛날에 라텍스글러브가 많이 사용안될때 맨손으로 컬쳐하고 그랬는데요.
컬쳐시작 30분전 미디엄 빼고 파이펫팁통, 피펫, 피펫에이드를  uv로 소독시키는 겁니다.   

오멘  |  2013.05.03    
컨탬이 어떤종류가 되는지부터 알아보는것도 도움이 될 것같네요
예전에 맨날 yeast 컨탬시키던 사람이 알고봤더니 집에서 빵만드는게 취미였다는..
컨탬 종류가 mycoplasma, virus, yeast, ecoli등이 있어요 어떤게 원인인지 아는것도 도움이 될 것같아요..
Peace! 
나그네  |  2013.05.04    
선생님 답변을 드릴까 합니다.
윗분들 말씀처럼 가장 기본적인 것도 중요합니다. 또한 알콜로 소독하셔도 전체적인 Contam을
줄이기에는 한계가 있으므로 전문시약을 사용하시는 것도 중요합니다.
저희는 Biological industries社 Mycoplasma 예방(Virus,Yeast...), 검출, 치료제를 판매하고 있습니다.
제품은 다음과 같습니다.
1.Phamacidal(1L):Spray형식이며, Co2 incubator, clean bench에 알콜처럼 뿌려주시면 됩니다. 닦지마시구요, Cell이 있는 dish나 plate 걷어내지 않으셔도 전혀 문제 없습니다. 1년정도 사용할 수 있는 양이며 가격은 14만원입니다.
2.Aquaguard-1: 100ml로 10ml정도씩 Co2 incubator內 습도를 맞추기 위한 dish에 풀어서 넣어주시면 contam예방이 됩니다. 가격은 14,000원입니다.
3.Aquaguard-2: 50ml로 마찬가지로 water bath에 10ml?정도씩 풀어서 사용하시면 예방이 됩니다. 가격은 22,000원입니다.
그리고 Mycoplasma test kit도 판매하고 있구요
Contam걸린 Cell 들을 치료하는 BioMYC-1,2,3제품도 판매하고 있습니다.
도움이 되었으면 합니다.
www.insungscience.com
031-296-0116 
알서울클리니칼지노믹스  |  2013.05.06   
Happycell이란 제품 사용을 적극 추천해드립니다. 물또는 알콜과 희석해서 사용(고농축)
다용도로 실험실에서 사용할 수 있습니다. 거의 대부분의 균 및 마이코플라즈마까지 제거.
CO2 인큐베이터 및 Water bath에 오염유무 판단(indicator제공 : 색깔로판단)
사용은 아주 간단합니다. 인체 무해 및 셀에도 전혀 영향을 끼치지 않습니다.

국내회사에서 제조한 제품입니다. 가격도 외산에 비해서 저렴합니다 Delivery빠르며, 샘플 필요하시면 언제든지 공급해여. T : 02-741-7953
개구리ExDown's  |  2013.05.06   
glove를 쌔거로 항상 사용하시나요?

cell culture시에 가장 중요시되는건 glove를 새것을 사용하는것입니다.

미디어 안에 Antibiotic 을 1% 넣으신건 맞으시죠?

미디어의 색변화는 ph변화때문이지,contam의 의심요소는 아닙니다.


개구리ExDown's  |  2013.05.06   
glove를 쌔거로 항상 사용하시나요?

cell culture시에 가장 중요시되는건 glove를 새것을 사용하는것입니다.

미디어 안에 Antibiotic 을 1% 넣으신건 맞으시죠?

미디어의 색변화는 ph변화때문이지,contam의 의심요소는 아닙니다.


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