[DEBUG-WINDOW 처리영역 보기]
즐겨찾기  |  뉴스레터  |  오늘의 정보  |  e브릭몰e브릭몰 회원가입   로그인
BRIC홈 실험
2019 Bio Top5 인터뷰
스폰서배너광고 안내  배너1
전체보기 안전점검 논문교환 LABox
 전체 > Etc.
조회 1737  스크랩 인쇄하기 주소복사 트위터 공유 페이스북 공유 
질문 beta mannanase 분석법의뢰
알L204  |  2013.04.11 18:45
기원이 다른 mannanase를 동일한 방법으로 비교분석하려 합니다.
이유는 두가지 효소의 역가가 동일하다는 것을 보여주기 위함입니다.
enzyme1 : bacillus sp
enzyme2 : trichoderma sp
실험법은 아래와 같습니다.
내용이 상당히 길지만 좋은 답변 기다리겠습니다.

Assay Method for Mannanase Activity (pH 6.0)

 

1. Sample preparation

1.1. Preparation

1. Extract the enzyme from the sample by continuously mixing 3g of the sample and 27ml

of 20mM sodium phosphate buffer (pH 6.0) for 1 hr. (Be sure not to lose enzyme

activity by maintaining the temperature.)

2. Centrifuge the mixed sample for 30 minutes at 12000rpm.

3. Use the supernatant of this as an enzyme solution.

 

2. Reagents:

2.1. Preparation

2.1.1. 1.0%(w/v) locust bean gum substrate (LBG)

1. Add 90ml of distilled water(DW) to 1.0g of locust bean gum (SIGMA G-0753 from

seeds of Ceratonia siliqua),

2. Mix 30min with magnetic stirrer under warm condition (ca. 50-60C) and fill to 100ml

with DW.

3. After autoclave, mix 30min with magnetic stirrer. Substrate should be mixed all the

time when used.

4. Substrate is usable for 1 days if stored in refrigerator.

 

2.1.2. Dinitrosalicyclic acid (DNS) reagent

5. NaOH 1% --------------------------------------------------- 20g

6. 3,5 - Dinitro Salicylic Acid 1% ------------------------ 20g

7. Phenol 0.2% ------------------------------------------------ 3.74ml

8. Sodium Sulfate 0.05 % -------------------------------------1g

9. Potassium sodium tartrate tetrahydrate 20% ------- 400g / 2L

10. (Rochelle salt)

11. Suspend 20.0g of 3,5-dinitrosalicylic acid in about 800ml of distilled water.

12. Add gradually 300ml of sodium hydroxide solution (20.0g NaOH in 300ml of distilled water) while stirring continuously.

13. Warm the suspension in water bath (the temperature may not exceed +48C) while stirring until the solution is clear.

14. Add gradually 3.74ml phenol (d=1.07g/ml), 1g sodium sulfate and 400g of potassium sodium tartrate tetrahydrate (Rochelle salt).

15. Fill to 2000ml with distilled water and stir it overnight.

16. Store in a dark bottle at room temperature. Reagent is stable for 3 months.

17. And with this new DNS solution, a new standard curve should be drawn.

 

3. Procedure

3.1. Enzyme & Enzyme blank sample

1. Aliquot the prepared 1.0% locust bean gum solution by 150 into 1.5ml tube.

2. Choose the right pH of buffer for each different enzyme and add 75 of the selected

0.2M sodium phosphate buffer. The final concentration of buffer is 50mM.

3. And enzyme could be added up to 75 . If you add less, you make up rest volume with

20mM sodium phosphate buffer. The buffer should be at same pH.

4. Here is the example.

1.0% locust bean gum ------------------------------------------------------- 150

0.2M sodium phosphate buffer (pH 6.0) ---------------------------------- 75

20mM sodium phosphate buffer (pH 6.0) --------------------------------- 55

Enzyme ---------------------------------------------------------------------------- 20

-------------------------------------------------------------------------------Total 300

5. For the reaction, the three solutions, except enzyme, are mixed first and spin down a

few seconds. And pre-warm for 5 minutes at 50. (The temperature could be different according to the goal of test.)

**Make two reaction mixtures and two controls for one sample (duplicate test).

6. After 5 minutes, start reaction by adding enzyme at regular intervals (Usually 20 sec to 30 sec). -Do not add enzyme into control.

7. After 15 minutes, add 900 of DNS solution into each reaction tube at the same intervals with the beginning of the reaction. Vortex mediately.

6. Spin the tube and fix on a rack.

8. Boil at 100 for exactly 5 minutes and cool down immediately in cold water.

9. If it is cool enough, centrifuge for 5 minutes to remove non-reacted locust bean gum.

10. After centrifugation, examine the OD of the supernatant at 540nm. Be careful not to take locust bean gum from the bottom of the tube. (1ml is favorable for checking). -If the OD is too high, retest with less enzyme or more diluted enzyme.

The absorbance difference of enzyme sample and enzyme blank should be 0.3~0.5 (OD).

 

3.2. Caculation

If the mannose standard curve equation is y = k * x + C0

([OD] * k + C0) * 1000 * Df *15

Activity (U/g) = ----------------------------------------------

MWman * t

Where

OD = absorbance of the enzyme sample – absorbance of the enzyme blank

C0 = the intercept of mannose standard curve

k = the slope of the mannose standard curve

1000 = factor, mmol umol

Df = dilution factor (ml/g)

15= dilution factor, (300ul/20ul)

MWman = molecular weight of mannose (180.2mg/mmol)

t = reaction time (15 min)

 

4. Standard curve

4.1. Preparation

1. Dissolve mannose in 50ml volumetric flask to the concentration of 1g/10ml.

2. After completely dissolved, dilute to1mg/ml by using 15ml falcon tube.

3. Mix 1mg/ml of solution with D.W at 1:1 for 0.5mg/ml.

Mix 0.5mg/ml of solution with D.W at 1:1 for 0.25mg/ml.

(500 of solution : 500 of D.W)

4. Mix 1mg/ml of solution with D.W at 3:7 for 0.3mg/ml.

Make two tubes of this concentration for 0.15mg/ml.

(300 of solution : 700 of D.W)

5. Mix 0.3mg/ml of solution with D.W at 1:1 for 0.15mg/ml.

6. Mix 1mg/ml of solution with D.W at 3.5:6.5 for 0.35mg/ml.

(350 of solution: 650 of D.W)

7. Mix 1mg/ml of solution with D.W at 2:8 for 0.2mg/ml.

(200 of solution : 800 of D.W)

8. Mix 0.2mg/ml of solution with D.W at 1:1 for 0.1mg/ml.

9. Mix 0.1mg/ml of solution with D.W at 1:1 for 0.05mg/ml.

10. Draw standard curve with those solutions.

- The concentration would be 0, 0.05, 0.1, 0.15, 0.2, 0.25, 0.3, 0.35 mg/ml.

11. 300 of the solution with each different concentration is added into 1.5ml tube. Each solution is added into two tubes and 0mg/ml is just D.W.

12. Directly add 900 of DNS without reaction.

13. Vortex and spin down a few seconds. Boil at 100 for 5 minutes.

14. Exactly 5 minutes later, cool it down and check the OD at 540nm.

15. Get the average OD of the samples and subtract the OD of 0mg/ml.

16. Draw the curve with average OD as X axis and concentration of mannose as Y axis.
----------------------------------------------------------------------------

문제점
1. 실험할 때 마다 분석치가 너무 상이합니다.
저희 lab에서 분석할 때랑 제조사에서 분석할 때랑 제 3의 기관에 분석의뢰를 할때에도 모두 다른 수치가 나타납니다.
2. 실험 시 기질을 locust bean gum을 사용하는데 이 기질이 잘 용해되지도 않을 뿐더러 점성이 매우 높습니다. 또한 동일한 실험을 30분 후에 진행하였을 시에 절반정도의 역가가 측정됩니다.
질문
1. 위 실험법 자체가 오류가 있는 실험법인가요?
2. mannanase를 분석할 시 일반적으로 쓰는 실험법은 어느것이가요?(bacillus기준)
3. 제 3의 기관에 의뢰하였을 때
enzyme1은 기대치가 나오고
enzyme2는 기대치에 1/12정도의 역가가 나타나는데 원인은 어떤것이 있을까요?

소중한 답변 기다리겠습니다.

#enzyme
 
#mannanase
답변하기
검색광고 검색광고
[필코리아] NEB(New England Bio labs)한국총판 필코리아에서 주문하세요!
Cloning관련 Enzyme의 명가 NEB (New England Bio labs) 한국총판 필코리아입니다. 저렴하고 빠른 배송으로 보답해드리겠습니다. 전국 어디서나 주문하세요. T:02-2105-7020, F:02-2105-7025, mail: info@philekorea.co.kr
답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
개구리carpe diem  |  2013.04.17   

예전에 실험한 적이 있긴합니다만
프로토콜 상 별 차이가 없네요

점성이 있는 기질을 사용할 때는 스탁을 만들어서 사용하면
아무래도 각 실험간에 편차를 좀 줄 일 수 있습니다.
점성이 있는 기질은 한 번에 다 넣어 녹이지 말고 조금씩 천천히 녹여서
기질을 좀 더 골고루 믹스해주는 것이 중요합니다.
이런 실험에는 특히 컨트롤과 스탠다드커브가 중요한 것은 아실꺼에요

기본적이기는 하나 재조합엔자임의 양을 농도별로 처리해 보셨나요?
스탠다드 레인지 안에 들어오는 엔자임의 농도를 아는 것이 중요합니다.
스탠다드의 신뢰도는 어느 정도 입니까?
엔자임 반응은 특히 이런 스탠다드커브의 알스퀘어값이 중요합니다.
99%이상 일 때를 사용하시기 바랍니다.

DNS솔루션은 빛에 민감하므로 갈색병에 보관하라고 되어있는데
알루미늄호일로 한겹 더 쌓아두면 좋습니다.

기질자체가 점성이 있기 때문에 스펙을 측정하기 전이나 각각의 솔루션들은 섞을 때
균일하게 섞어주는 것이 중요합니다

mannanase를 만드는 회사를 찾아서 분석법에 대한 조언을 구해보셔도 좋을 것 같습니다.
제가 알기로는 CTC바이오라는 회사에서 생산하는 것으로 알고 있습니다.
이외에도 몇 개 벤처들에서 만들고 있을꺼에요
회사같은 경우에는 QC까지 하기 때문에 아무래도 이런 분석법들이 제대로 셋팅되어 있죠
나름의 노하우도 있구요

도움이 되셨을지 모르겠네요
좋은 결과 있으시길....

답변하기
할인행사 광고 검색광고
코람바이오텍 코람바이오텍
[OriGene] IHC Reagents, shRNA, CRISPR, Proteins, Lentivirus.. (4.27까지)
에펜도르프코리아 에펜도르프코리아
Eppendorf New 25mL Conical Tubes : 혁신적인 디자인과 다양하고 편리한 사용 (4.1까지)
외부제휴사 광고 AD
e브릭몰
βeta
4/6  좌우
867,100824,000
92,80088,000
225,200214,000
140,100133,000
71,30068,000
121,100115,000
79,70076,000
603,600573,000
147,600140,000
691,800657,000
239,800228,000
316,000300,000
90,60086,000
102,30097,000
374,800356,000
153,000145,000
242,000230,000
199,100189,000
404,600384,000
522,300496,000
625,100594,000
158,400150,000
119,600114,000
272,300259,000
최근등록   더보기 >
대장조직 해부(swiss roll 방식) 관련 질문이요..   02.23
knock out 마우스 국내보유 검색방법   02.23
3M petri dish를 사용한 미생물 측정 방법 (대장균, 일반세균용)   02.23
발효액 안에서 미생물 추출   02.22
손세정제를 소독용 에탄올 대신으로 써도 될까요?   02.22
Desoxycholate Lactose Agar 배지 색 변함   02.22
ImageJ mean gray value 질문입니다   02.22
단백질 농도 측정 시 계산 법   02.22
코로나19 같은 바이러스 관련 실험문의입니다!!(급합니다ㅜ)   02.22
세포가 오염돼서 죽은 거 같아요   02.21
라이브셀인스트루먼트
ZEUS
위로가기
실험 홈  |  실험FAQ  |  실험 문의 및 제안
 |  BRIC소개  |  이용안내  |  이용약관  |  개인정보처리방침  |  이메일무단수집거부
Copyright © BRIC. All rights reserved.  |  문의 member@ibric.org
트위터 트위터    페이스북 페이스북   유튜브 유튜브    RSS서비스 RSS
에펜도르프코리아