현재 7cm, 3-11NL strip에 protein이 60ug이 되도록 loading하여 실험을 수행하고있습니다.
IEF후 PAGE gel에 loading한 후 CBB-G250으로 stain하여 확인중인데요..
사수분께 배운 실험 step을 완전 똑같이 적용하고, 시약도 같이 사용하고, 달라진거라곤 cell line뿐인데..
spot의 진하기나 수가 너무나도 많이 차이가 납니다..ㅠ cell line별 차이라고 하기에는 너무 심할정도로 차이가 나니 원인을 모르겠네요.
혹시나 handling상의 문제라고 생각하여 진짜 신중을 기해 sample의 loss가 없도록 준비하여 실험을 수행해보아도 결과가 계속 한결같이 spot이 적게 나오네요..ㅠ
IEF상에서 salt에 의해 뭔가 영향이 있을까 했지만 step상 sample에 salt가 전혀 들어가지 않습니다.. lysis buffer 자체를 rehydration buffer 조성과 거의 흡사하게 만들어놓고, lysis한 sample을 그대로 2D에 사용하고있는지라..
거의 사수분과 저의 spot차이가 아래 두 그림정도로 차이가 납니다.. sample양도 동일하게 거는데 말이죠..ㅠㅠ IEF protocol도 동일하게 사용하고 있고 strip도 함께 구매해서 같이 사용중입니다.. 원인을 도무지 알수가 없어서...2D 실험 자체가 안되는것도 아니고 spot수가 적다고 screening수행하기가 힘들다고 하시니...