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 전체 > Molecular Biology-Protein > Western Blot Analysis
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질문 western blot 밴드가 이상합니다. ㅜ (그리고 western blot시 주의사항도 알려주세요)
western  | 2013.02.28 18:05
답변있는 질문은 수정/삭제 불가(☞문의)
첨부파일 파일첨부: 그림.bmp (187 KB)

western blot할 때 항상 첫번째 레인은 마커를 걸고 두번째부터 샘플을 로딩하는데
첫번째 샘플(즉 두번째 레인)이 항상 밴드가 약합니다.
1번 그림과 2번 그림은 동일한 멤브레인이고 1번은 제가 알아보고자하는 ab로 잡은 것이고 2번 그림은 tubulin입니다. 정량에는 문제가 없어 보이는데 왜 그럴까요?
ab는 4도에서 O/N했고 비율을 두가지를 써보아도 마찬가지 입니다. (새로 dilution해서 써보기도 했구요) 혹시나 싶어서 첫번째 샘플을 맨 마지막 레인에도 걸어봤는데 마지막 레인에는 멀쩡합니다.

3번째그림 질문은 밴드 모양이 왜 저렇게 나오는지 궁금하네요

실험에 쓰이는 버퍼는 공동으로 쓰는데 다른 사람들은 잘 되는 것으로 봐서 문제는 없어 보이구요 방법에 문제가 있어 보이는데 뭔지 잘 모르겠습니다.
이외에도 혹시 western blot할 때 특별히 주의해야할 사항들도 있으면 알려주세요

실험에서 5% skim milk사용했고 primary ab는 4도 O/N, secondary ab는 실온 1시간 붙였습니다.

#western blot
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
질문자  |  2013.02.28    

질문자인데요 1, 2번 그림에서 1번째 샘플이 negative control이어서 두번째나 세번째보다 약하게 나오면 안되는 밴드입니다.

무슨  |  2013.02.28    

어떤실험인지 내용을 몰라서 정확한 대답은 가능하지는 않을것 같고.. 왜 첫번째 밴드가 약하게 나오면 안되는지.. negative control이라고 나머지 샘플보다 작게 나오면 안되는 이유가 무엇인지 잘 이해가 안되네요. 첫번째 레인이 control이면 두번째 세번째 샘플이 control보다 발현량이 높은것으로 해석하면 안되는것인지 ?  항상 결과가 그렇게 나오면 그것은 웨스턴 문제가 아니라 그것이 실험결과가 되는것이죠.

3번째 그림의 밴드모양은 무엇이 문제인지도 모르겠습니다. 일자로 안나와서 문제인가요? 그런것을 왜 걱정하는지도 이해가 안되네요. cell paper보더라도  이런저런 밴드 많이 있습니다.

질문자  |  2013.03.01    
무슨/
첫번째가 negative control이고 두번째 샘플이 발현이 더 억제되도록 다른 유전자를 transfection한 것이기 때문에 그렇게 말한 것입니다. (제가 이건 처음해보느것이 아니고 타 논문에도 많이 나온 내용이고 저희 실험실에서도 동일한 결과가 나왔는데 제가 지금 재현하고 있는 것입니다)

세번째 그림은 밴드가 일자로 항상 나오다가 저렇게 나온것이어서 궁금했던 것입니다.
무슨  |  2013.03.02    
질문자님//알겠습니다.
근데 tubulin이 동일하게 나오면 같은 브랏에서의 다른 밴드를 western 상의 오류로 보기에는 무리가 있습니다. 그것도 항상그렇게 나온다면.. 실험시스템을 둘러보는것이 옳을듯..
질문자  |  2013.03.04    
무슨/답변감사합니다.
ㅎㅏ나  |  2020.05.01    

저도 비슷한 문제로 고민하고 있느데 원인을 찾으셨나요?

 

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