고수님들이 많으실텐데 제 간단한 경험으로 비춰보아 몇가지 제시해보겠습니다 ^^;;
1. 그 protein이 정말 그 sequence 에 붙을지
(그 sequence에 붙는걸로 알려진 positive control protein으로 먼저
실험을 해보시면 좋겠습니다)
2. bead 사용 전 washing문제
(ready-to-use라면 washing없이 구입 후 바로 따서 써도 되겠지만
제품에 따라서는 PBS등으로 bead자체를 washing후 써야되는경우도
있습니다)
3. bead binding 시에 왜 RT 에서 하셨는지 (western blot으로 보는건데 4'C에서 rotation 하셔야 좋지 않을까요)
4. extract+probe+bead를 두시간동안 binding시킨 것의 문제
(제가 찾아본바로는 extract+probe를 먼저 binding 시키는데
저의 경우나 사람들의 경우나 길게는 4'C O/N rotation합니다. 그리고
그 이후에 bead를 넣고 한두시간 rotation합니다. 일반적인 경우에요.)
저도 이걸 해보긴 했는데 과정상으로 딱히 뭐 때문이다라고 한마디로
정의하긴 어렵구요.
(이 실험이 워낙 protocol이 제각각이라서요...)
그나마 의심가는 몇가지를 꼽아보라면 이정도네요.
그리고 본문에 나와있는거랑은 크게 관계없을수도 있지만 그래도 말씀드리고픈것은요.
기본적인 pull-down류의 실험에선 pre-clearing을 하시는게 좋은걸로
알고 있구요. 이런 oligonucleotide pull-down이나 EMSA같은실험에서는
poly-dIdC같은걸 넣어서 oligonucleotide에 nonspecific하게 붙는 protein 들을
걸러주는게 좋아요.
저는 이 실험 처음 세팅할때 수많은 논문을 보고
각각의 사람들이 하는 방법을 다 따놓고
가장 베이직한 방법부터 따라해서 protocol을
완성했습니다. 작성자님께서는여기에서 얻는 조언 이전에
이 실험이 나온 논문을 우선 많이 찾아보시고 고민해보시고,
어느정도의 구체화된 생각이 바로서면 이곳에서 얻는 조언을
다시 참조해보셨으면 좋겠습니다.