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 전체 > Molecular Biology-DNA > PCR/RT-PCR/Q-PCR
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질문 real time PCR에서 Melt curve에 관해서
알프리지아605  | 2013.01.04 10:16

real time PCR에 대해 초보자 입니다.
real time PCR 결과에서 Melt curve의 의미를 알고 싶습니다.
특히 derivation reporter (-Rn')가 의미하는 것이 무엇이고,
이 그래프는 어떻게 해석을 해야 할 지 몰라 여쭤봅니다.
아시는 연구자님들 답변 부탁드립니다 ㅠㅠ

#real-time PCR
 
#melt curve
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
개구리명품남자  |  2013.01.07   
초보자라 하시니 알아듣기 쉽게 말씀드리죠

melting curve

반응되어 만들어진 product를 가지고 온도를 1도씩 올리면서 분석을하면요

지속적으로 denaturation되다가 어느온도에 올라서는 순간 product가 모두 denaturation 되게되겟죠?

그럼 커브는 마치 가파른 산처럼 어느 온도까지 올라가다가 정점을 찍고 그이상 온도로 올라가면 다시금 가파르게 떨어지게 되겟죠

그 정점에 다다른 온도가 PCR product의 melting temperature입니다.

이를 통해 알 수 있는것은 pcr이 제대로 수행되었는지 여부죠

primer가 제자리에 못붙고 여기저기 붙어서 엉뚱한 product를 만들었는지... 아니면 primer가 아예 붙지 못했는지 지들끼리 붙었는지 등등을 알수 있죠.

결론적으로 PCR이 잘되었고 ct값을 믿을만 한지를 확인할수있는일차적인 방법입니다.

RN- 쉽게 설명해서 형광다이의 형광값이 증폭되는 pcr 산물에 따라 detection되는겁니다. 그렇기때문에 초기 template가 많은경우 보다 적은 cycle에서 보다 높은 값을 갖게 되는거죠. 그런것들을 수치화한것이기에 raw data는 크게 신경쓰지 않아도 됩니다.

threshold값을 0.1 내지 0.2 또는 본인의 실허에 맞게 맞춘후 나오는 ct값을 이용해 상대정량을 하는것이 delta delta Ct analysis죠.

간단히 설명드려서

1차적으로 나온 Ct값을 이용해서 본인의 sample에서 internal control로 사용한 유전자(GAPDH등)의 Ct값을 빼줍니다. sample이 1~5번이라면 internal control도 1~5가 있어야겠죠. 이를 dCt값이라 칭합니다.

그다음 samlpe에서 control이 있으면 다시금 그 값을 이용해 다른 sample에 Ct값에서 빼줍니다. sample 1이 control이라면 1-1, 2-1, 3-1, 4-1, 5-1 이런식이죠 이를 ddCt값이라 칭합니다.

그럼 아마 1번의 경우 값이 0 또는 0과 가까운 수가 나오겠죠?(n수가 두개이상인경우, 평균 0입니다) 나머지는 제각각 - 값을 갖거나 +값을 갖겠죠

그럼 마지막으로 그 값을 이용해 Relative quantity값을 구해야합니다
식은 2^-(ddCt값) 입니다. excel에서 작업하면 편하게 할 수 있죠.


다 아는것을 썻을까 싶지만 혹시나 모르는 후배님들을 위해 자취를 남기고 갑니다.

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