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 전체 > Molecular Biology-Protein > Western Blot Analysis
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질문 western sample준비과정 질문입니다.ㅠ
올챙이실험.입문자  | 2012.12.07 13:44
현재 western 수행시 sample을 cell lysate 자체로 사용하고 있습니다.

헌데 문제가 sample을 10ug으로 loading하고있는데..
10번을 넘도록 western을 수행해도 house keeping gene의 정량이 맞질 않더군요.
정말 손이 장애인가 심각하게 고민하던 찰나 해결법을 찾았습니다..

10ug의 sample이 20ul에 들어가도록 sample준비를 하고있는데..
이를 30ul로 늘리고 비례해서 sample을 1.5배 더 넣은다음
거기서 20ul를 따서 loading했더니 정량이 한방에 맞아버리더군요...
아 내 시간..ㅠㅠ
기존에는 20ul 로딩해야하면 20ul를 딱 맞춰서 sample을 만들었었거든요..

근데 여기서 문제가 되는것이,
sample을 준비할때 동량으로 거는것이 10ug이 되도록 계산을해서 단백질의 g수로 맞추는건데,
30ul로 늘려서 이중 20ul를 건다고하면 딱 10ug이 안되지 않습니까?

헌데 실험방법상 이 10ug을 정확하게 맞추는것이 중요한게 아니고
정량을 편하게 하려고 10ug으로 적정 sample량을 정한거긴 합니다만..

30ul에 15ug이 들어가도록 준비한 후 이중 20ul를 따서 사용하여
house keeping gene의 정량이 맞는다면..
이게 20ul에 10ug이 들어가도록 타이트하게 준비하여 로딩하는것보다
많이 부정확할까요..?

20ul를 딱 맞춰서 준비하면 PAGE gel에 로딩할때 절대로 20ul로 동일하게 로딩되지 않더군요..ㅠ
boiling 단계에서 증발하는게 있는건지..
뚜껑은 안열리고 spin도 잡고 로딩합니다만...
소량 pipetting에 소질이 없는건지..

30ul 15ug으로 준비하여 이중 20ul만 따서 쓰더라도 house keeping gene의 band양상만
동일하게 detection 된다면...
당장의 문제는 없는거 아닐까요..?

브릭회원분들 의견은 어떠신지요??
#western
 
#sample
 
#정량
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
엘피스바이오텍  |  2012.12.08    

제 경우, sample을 준비할 때 딱 한번 loading하는 분량을 준비하지 않습니다.
가령 10ug을 10ul로 loading해야 하는 경우라면 100ug을 100ul가 되도록 준비하고 끓인 후 이중 10ul만 loading을 합니다.

이리하는 이유는 크게 두가지 입니다.
저는 개인적으로 reprobing한 후의 data를 믿지 않기 때문에 여러개의 단백질을 동시에 봐야 하는 경우를 위해 또 다른 blot을 준비하기 위한 것이고 또 한가지 이유는 적은 volume의 sample보다는 많은 volume의 sample을 준비하는 것이 sample간 차이를 최소화할 수 있기 때문입니다.

30ul를 준비해서 20ul를 loading하는 것이 sample이 한정적이기 때문이 아니라면 그 보다 많은 volume으로 준비하는 것보다 더 정확할 겁니다.

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