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 전체 > Molecular Biology-DNA > PCR/RT-PCR/Q-PCR
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질문 pcr 문제좀 해결해 주세요..
pcr초보자  |  2006.05.19 00:00
답변있는 질문은 수정/삭제 불가(☞문의)
첨부파일 파일첨부: brachyury2.mdi (39 KB)
몇달동안 pcr때문에 고생하고 있는 pcr 초보자 입니다..!!!!!!!!
primer dimer가 너무나도 또렷이 찐하게 나와서 고민인데요, product band보다도 한 4배정도는 굵게 나옵니다. 그리고 두번째 lane에 product band가 보여야 되는데도 보이지 않구여.. 혹시 primer 양이 (10pmol)너무 많이들어갔나 하고서는 반으로 줄여봤을때는 오히려 전체 lane이 smear한 primer dimer만 나오더라구여.. negative control까지도 primer dimer가 나오는데 어떻게 해야 할지 모르겠어요.. 맨 마지막 lane이 negative control이구여..
원래 template를 1micro litre넣었는데 smear한 band만 나와서,, template를 0.6 micro litre로 줄여봤거든요. 그랬더니,, product band가 약하게 하나가 나오더라구여..primer dimer랑 같이요..
고수님들 한번 보시고 작은 답변이라도 달아주세요. 감사합니다..

#pcr
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
엘피스  |  2006.05.19    
오랜만에 브릭에 들어오네요 ^^

우선 primer-dimer는 PCR에 사용하는 primer에 따라 현저히 달라집니다. Primer-dimer란 primer끼리 유사한 sequence가 있어 달라붙어 extension이 되는 것이므로 primer (intra 또는 inter)내에 결합가능한 유사서열이 없는지 꼭 사전에 확인을 하시는 것이 좋습니다. 그외에 hairpin구조라던가 misprimining site라던가 여러가지를 또한 확인을 하셔야 합니다. 이것이 일차적인 문제로서 primer-dimer를 줄일 수 있는 90%의 비법이고....

어쩔 수 없이 primer를 조건없이 짜야 하는 경우가 있거나 또는 남이 해놓은 것을 받아쓰는 경우엔 적합한 primer design은 불가능할 겁니다. Primer의 조건이 나쁜 경우 반드시 primer-dimer는 뜨게 되어 있는데 보통은 미약하게 뜨므로 그냥 데이타로 사용해도 무관하지만 (약간의 non-specific이나 background는 인간적이라? 저로선 선호하는 편이지만...) 사진에 있는 것처럼 무지막지 하다면 PCR조건을 조절하여 줄일 수 있습니다.

1. annealining temperature의 조절 : 온도를 조금씩 올려봅니다. 그이유는 primer끼리의 binding은 일부 sequence만 관여하기 때문에 전체primer가 결합하는 조건보다는 온도가 낮습니다.

2. hot start : primer끼리의 mis-priming을 완전히 없애준 후 annealing/extension이 될 수 있도록 해줍니다. Hot-start Taq을 사용하는 것은 낭비라고 보여지며 간단히 할 수 있는 방법으 말씀드리면, 한두개의 tube인 경우엔 초기 94C가 끝난 시점에서 Taq을 넣어주는 것입니다. 샘플이 여러개인 경우라면 94C에서 초기 denaturation을 해준 후 얼음위에 꼽고 Taq을 각각 넣어주면 됩니다. 어차피 Hot-start Taq이라는 것도 antibody를 이용해 Taq의 활성을 denaturation이전까지 잡아주는 것뿐이므로 위에서 말씀드린 것과 별반 다르지 않습니다. 결과는 아주 효과적입니다.

3. PCR additive : BSA, DMSO, betaine 등 PCR의 증폭효율을 높여주고 non-specific을 줄여주는 다량한 첨가제들이 있습니다.

4. Taq : 회사마다 Taq의 성질이 약간씩은 다릅니다. 대부분의 Taq들은 무조건 yield만 높여놓은 것들이 많고 많은 사용자들은 band만 빵빵하면 좋은 Taq이다란 인식들을 가지고 있습니다. 하지만 PCR로 고생해본 사람이라면 무조건 yield만을 고집하지는 않고 다양한 측면을 고려합니다. Yield는 적지만 speicificity가 높고 조건이 stringent가 높은 Taq이 primer-dimer의 발생빈도도 낮습니다.

여러가지를 적었지만 PCR에서 최상의 결과는 90%이상, 아니 99%까지 primer에 의해 결정됩니다.

미네르바  |  2006.05.19    
엘피스님께서 아주 좋은 답변을 해주셔서 저는 특별히 할 말은 없지만...
Template의 양을 좀더 조절해보시는 것도 한가지 방법일거 같네요
같은 primer라고 할지라도 100% specific한거 아닌이상 template의 양에 따라 차이가 나거든요
님께서는 그냥 vol.로만 말씀을 하시지만...conc.로 생각하심이 좋을듯 합니다.
그럼 좋은 결과 있으시길...
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