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질문 RT-PCR 관련 문의 드립니다(RNA).
알대학원생  |  2012.10.25 11:54

안녕하세요.
RNA 실험 하고있는 대학원생입니다.
항상 선배님들의 답변 및 글 감사 드립니다.

이번에 여쭙고자 하는 것은  제가 RT-PCR 을 셋팅 하고 있는 단계입니다.

분석전에 모든 기구들을 멸균을 시키고 필터팁도 사용하고있습니다. RNA ZAP도 사용하고 있구요. 근데 업체에서 오토클레이브를 돌려도 RNA 사멸이 거의 일어나지 않는다고 그냥 멸균하지 말고 사용하라고 하셨는데요. 정말 멸균을 하지 않고 사용을 해야하는 지요? 멸균 과정에서 오염이 더 될수도 있다고 하는데 어떻게 해야하는 것인지요? 마이크로 튜브, 팁, rna 추출하기전 사용하는 기구들도 다 멸균을 합니다. 어떻게 하는게 해야할까요? 그런데 저희 실험실에는 오토클레이브가 없어서 미생물 실험하는 실험실꺼를 같이 사용하고있습니다. 괜찮을까요?

실험도중 네가티브에서 증폭이 되어서 여쭤봅니다.

그럼 선배님들의 답변 기다리겠습니다.

#RNA
 
#RT-PCR
 
#Contamination
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
히옹  |  2012.10.25    
Auto clave 안해도 RT가 잘 된다면 안해도 됩니다.

하지만 안하고 해본적이 없어서요.

RNA는 Stability가 낮고 우리 주변엔 Rnase가 너무나 많습니다.

님 지금 하시는 대로 저도 똑같이 멸균 후 하고 있는데 잘 됩니다.
*^^*  |  2012.10.25    
이건 Real time PCR를 말씀하시는건지..Reverse transcription - PCR를 말씀하시는건지..
암튼 후자라면 filter tip까지 사용하실필요는 없습니다.

그리고 전 멸균은 homogenizer 정도만 하구요..특별히 해야할게 없지 않나요??
멸균  |  2012.10.25    
멸균안해도 가능합니다.

장갑착용 꼭하시고, 포장 뜯고나서 바로 멸균된 병에 부은뒤 사용하시면 크게 무리없습니다.

다만, 마음의 안정을 위해서는 하는게 좋겠습니다. 실험이 잘 안될때, 사실 가장먼저 그런부분이 의심되는건 어쩔수없기 때문에라도 하시는걸 권장하지만, 사실 안해도 가능은 합니다.

그런데 질문자님의 글을 봐서는 그런류의 문제가 아니라 프라이머의 문제가 아닌가 싶습니다.
또한 RT-PCR의 경우 Non-target control에서도 증폭이 됩니다.
어느정도의 Ct값을 같느냐가 문제지, 백그라운드가 전혀 없을것이라 단정할수는 없습니다. 특히나 SYBR이면 더할거구요.

개구리PCR  |  2012.10.25   
RNA는 구조가 약하기때문에 잘깨집니다. 그래서 항상 조심해야하는데, 특히 RNase를 조심해야하죠....사용하는 tip이라던가 tube가 이미 RAase free로 처리되어있다면 굳이 멸균작업을 하지 않아도 되겠지만, 그렇지 않다면 다른것들은 오토클레이브 하는것이 좋을것같네요.
RNase도 단백질이다보니 고온에서 파괴되거나 변형이되어버릴테니까요..
저 같은경우 RNA 실험시 사용하는 tip이라던가tube 모두 멸균하고 따로 사용했습니다.
업체에서 멸균과정에서 오히려 오염이날수있다고 한건 멸균후 건조과정에서 오염이날수있다는 말을 한게 아닌가 싶네요..은박호일같은걸로 감싸서 멸균후 건조하시면 괜찮을겁니다.
은박호일을 벗겨내고 사용하실때 겉을 RNA ZAp이나 DEPC처리된 용액으로 소독하신후 (분무)벗겨내고 사용하시구요.

네가티브에서 증폭이 되는경우는 종종 있습니다.
여러 원인이 있을수 있겠는데, 우선 primer부터 확인하시는것도 좋을것같네요.

 
알대학원생  |  2012.10.25   

real time PCR 이용한 분석 입니다.^^
선배님들의 답변 정말 감사드립니다.
참고하여 실험해 보도록 하겠습니다.
정말 감사합니다.

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