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레벨5
flu...
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07.02.12 18:10
참...암울한 현실입니다... PCR 기계가 많으면 동일하게 하면 되는데 그렇지도 못하고...
저도 싸이클수에 따라 band 싸이즈를 보려고 했었는데 참 문제가 많았었습니다..
진짜로 미친척 각 싸이클 전체를 해볼까도 생각했었으나...(저는 20~30 싸이클정도 생각했었어요...) 돈,시간 낭비라는 생각밖에 안들었습니다...
그래서 생각을 한게... 저희는 PCR 기계가 두개 있거든요... 그래서 extension 이 끝나고 post extension 을 10분 옆 기계로 맞춰놓고... 각 싸이클이 끝날때마다 꺼내서 옆에 기계로 옮겼었습니다...
어짜피 extension 끝나고 denaturing temperature로 올라갈때 온도 올라가는 시간이 있으니깐요...
하지만 저는 단지 예비실험격인 실험을 하는중이러서 저렇게 했었던거구요...
만약 본실험이라면 별로 추천해주고 싶지 않네요...
답변 감사합니다. 하지만 저희도 기계가 두대있어서 flu...님의 말씀과 같이 똑같은 방법으로 해왔었습니다만...그 결과 10분의 post extension이 별로 필요없다는 결론을 내렸었습니다.그리고 이 방법역시 각 싸이클의 extension이 끝나면 뚜껑을 열어서 tube를 옆기계로 옮기고 이과정을 반복해야 하지 않습니까? flu...님께서는 어떤 이유에서 이러한 방법들이 돈, 시간낭비라는 생각을 하셨는지 궁금합니다. 다시 한번 더 답변 부탁드리겠습니다.
90년대 초반 선생님께서 하신 방법과 같은 방법으로 RT-PCR의 cycle의존성 및 saturation point를 잡은 적인 있습니다 (그당시야 정량 PCR이라는 개념이 없어 기껏해야 endogenous control로 double PCR을 하던 시절이라). 민감도를 높이기 위해 방사선을 사용했고 PAGE gel 전기영동 후 x-ray film에 exposure하고 이를 densitometer로 비교분석하는 실험이었는데 마지막으로 그래프를 그려보면 아주 신뢰성 있는 그림들을 반복해 얻을 수 있었습니다. 실험자체가 아주 피곤한 (열고 따고 닫고의 반복) 과정이라 정량 PCR이 가능하다면 사실 추천해 드리고 싶지는 않습니다만... 상황이 그렇다면야....
마지막 10분의 extension은 A tailing을 하기 위함입니다. 누가 72C final extra extension time을 주라고 했는지는 모르겠지만 전혀 필요없는 과정입니다. TA cloning을 할때만 5분정도를 줍니다.
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레벨5
flu...
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07.02.12 19:43
PCR님...
위에서도 말씀드렸듯이 저는 단지 예비실험격인 실험을 하고 있어서 그랬던거에요...
아주 아주 중요한 데이타가 아니었기때문에 좀 낭비란 생각이 쪼끔 들었었죠 ^^;;
그리고 저희는 마지막 extension을 7분 해줍니다...
에궁... 암튼 님 좋은 결과가 나오길 빌께욤.......
답변 정말 감사합니다. 사실상 이러한 방법으로 실험을 하고 있으면서도 나오는 결과에 대해서 스스로가 신뢰를 할 수 없는 결과인것 같아...실험을 하면서도 답답하기만 합니다. 식이조절한 마우스의 조직으로 부터의 발현양을 컨트롤군과 비교하는 실험이기에 더더욱 그렇습니다. 극단적인 예로 27싸이클에서는 컨트롤군과의 비교값이 20%감소되없었던것이 28싸이클에서는 변화가 없는것으로 나오는 등...정말 말도 안되는 소리이지만 실제로 그렇습니다. 이러한 어이없는 것은 어떻게 설명이 가능할까요? 전기영동 등에서의 오차, 밴드분석에서의 오차, 아니면 PCR반응의 오차...등등 오차의 범위가 실제 20%이상이라면 컨트롤군과의 비교가 될 수 없는 상황이잖아요...
실제로 일반PCR에서의 오차가 이정도로 크게 나오나요?
그래서 컨트롤군과 비교했을때 그 비교값이 20-30%의 차이가 나면 이것이 오차범위라 간주하고 있습니다만...실제로 아닐 수도 있다는 생각에 똑같은 실험을 3번까지는 하고 있습니다. 나오는 결과는 컨트롤군과 비교했을때 감소한것은 3번 모두 감소하는 경향을 보이나 그 정도에서 차이가 난다는 거죠...어떨때는 10%감소 어쩔때는 20%감소 어떨때는 30%감소 이런식으로요...
그래서 그냥 이런 모든것을 오차범위로 간주하고 100%정도로 크게 차이가 나는 유전자를 찾고 있습니다만...가능성이 없는것 같아서... PCR이후에 western을 할 생각입니다만...만약 실제로 컨트롤군과의 차이가 20%정도 밖에 나지 않는다면 western을 해도 별로 큰 변화가 없다는 생각이 드는데...여기서도 오차가 있을테니깐요...
어쨌든 실제로 일반 PCR에서 오차가 이정도로 크게 나오나요? 그리고 위 상황에서의 20-30%정도를 오차범위로 단정 지어버려도 될까요? 그리고 이러한 상황을 어떻게 생각해 가면 좋을지 조언 부탁드리겠습니다.
일단 지금 상황으로서는 실험방법을 바꾸는것은 좀 어려울것 같습니다.
복잡한 질문입니다만 부디 답변 부탁드리겠습니다.
아참 마지막으로 이곳의 선생님은 pipet을 다루는 기술에 따라서 이 정도의 오차가 나온다고 굳게 믿고 실험방법이나 다른것에서의 오차는 생가지도 않고 단지 기술의 차이라고만 생각해버리는것 같아서...뭐 실제로 pipet기술의 차이도 크다고는 생각합니다만...일단 이것은 위의 문제에서 제외시키고 생각해주셨으면 좋겠습니다.
님들...실험 하시느라 바쁘시겠지만...위의 글에 대한 조언 부탁드리겠습니다. T.T
일반 PCR 기기를 이용해서 정량을 할수 있는 방법으로 competitive PCR이라는게 있습니다. 뭐 얼마나 정확한지는 나름대로 저자가 어필을 하고는 있는데...뭐. 직접 해봐야 알겠지만요..PubMed에 competitive PCR이라고 치면 논문이 나올겁니다. 참고해 보세요..