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 전체 > Molecular Biology-Protein > Western Blot Analysis
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질문 Western sampling에서 시간별로 heating 한다면..
잘 몰라서..  | 2012.09.21 04:33
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웨스턴 샘플 만들때, 2X sample dye 넣고, 보통 4~5분 정도 끓여주는것이 일반적인데, no heat, 그리고 1분, 2분, 3분, 4분, 5분 이렇게 heating후 확인해볼까 합니다만..이게 올바른 실험일까요?

이 샘플은 일반적인 cell extract가 아니고, purified된 single protein입니다. 그리고 his tag이 N-term 또는 C-term에 각각 tagging된 것이고요. 실험 목적은 이 protein 의 N-term이 매우 stable해서 다른 부위에 비해 denaturation되는 경향이 떨어진다는 것을 보여주기 위해서인데, western에서 N-term와 C-term his tagging protein을 anti-his 로 볼 경우 과연 차이를 볼수 있을까요? 또한 이런 비슷한 방법으로 실제 해보신 분이나, 논문에서 보신 분이 있으시면 좀 알려주세요...

#western
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
 |  2012.09.21    

SDS-PAGE원리를 가만히 들여다 보면 그것이 왜 부질없는 일인지 알 수 있을 것입니다.

지금 예상하시는 것 처럼 "N-term이 매우 안정적이어서 이놈은 열에 견디는 힘이 강하다"

이것을 보여주고 싶은 것이라면 sample buffer를 넣기전에 시간대별로 열처리를 하고 원심분리후 상층만을 western을 해보셔야 합니다. 물론 간단한 방법으로 시간대별 열처리/원심분리후 단백질 농도를 측정해보면 대략적으로 알 수 있기도 하지만.....

또한 열에 안정하다는 것을 보여주기 위해서는 열에 의한 의한 엉김 뿐 아니라 활성 저하현상도 현저하게 줄어 들었음을 보여주는 활성test도 병행되야 되리라 봅니다. 

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