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300b.p는 너무 아깝구요
DNA의 순도가 좋다면 50~70b.p 정도 앞에서 짜면 됩니다.
100b.p 정도 부터는 대부분 정확하게 읽어 내더라구요.
sequencing 하는 유전자의 크기에 따라 primer의 갯수도 달라집니다.
primer한개당 800~900b.p정도까지는 정확하게 읽어냅니다.
그리고 PCR처럼 앞뒤로 primer를 짜는게 아닙니다.
만약 원하는 gene의 sequence가 1000b.p가 넘는다라고 한다면.
primer(1) -----70 ---- 원하는 gene sequence 700b.p
primer(2)------70--------- 나머지 남은 300b.p
이런식으로 짜시면 됩니다....
이해가 가셨을지 모르겠네요 ㅠㅠ
primer(2)는 원하는 gene sequence에서 primer를 다시 짜는 겁니다.
이것은 primer(1)로 우선 sequencing 결과를 보고 난 이후, primer(2)를 어디서 부터 짤 것인지를 정하는 겁니다.
Nested PCR primer처럼 짜는 것이지요.
foward, reverse 2개 primer를 짜서 중복 검사를 하는 것이 아니에요~
이렇게 foward, reverse 2개를 짜는것은 이럴때 사용합니다.
아까 처럼 10000b.p이상이 되는 sequencing이라면
primer(1)-----70-------원하는 sequence 700.b.p--------남은300.bp-----70-------primer(2)
800이상이 되면 제대로 못읽는다 했죠? 뒤에 남은 300b.p를 primer(2)로 역으로 읽는 것입니다.
제가 쓰고도 글이 좀 그렇네요;;; 일단 답변 읽어 보시고 생기는 궁금사항 더 적어주세요
궁금사항에 대해 다시 답변 드릴께요
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primer
(비회원)
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12.09.02 13:50
답변 정말 감사합니다.
다른건 이해가 가는데요 forward, reverse로 짜야하는 경우를 설명하신건
제가 머리가 나빠서 이해를 못하겠어요..ㅠ
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레벨5
당근시른토끼
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12.09.03 20:24
5`-------------------------------------------------------------------3`
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읽기 힘든 지역
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F primer R primer
윗님이 말씀하신데로 seqeuncing은 유전자의 size가 길어지면 길어질수록 후반부는 제대로 읽히지 않습니다. 이럴 때 reverse primer를 이용하여 잘 읽히지 않은 gene의 후반부를 읽어주면 됩니다. reverse primer로 sequencing을 할 경우 보라색 부분의 gene의 처음부분이 되니까 제대로 읽어줄 수 있습니다.