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sein und zeit
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12.08.21 09:54
분명한 것은 1% NP-40 이 있는 상태에서 왠만한 항체들은 거의 변성없이 활성을 나타냅니다. 따라서 항체의 불활성, 변성 등의 문제는 아닌 듯합니다.
제가 생각할 수 있는 해결방법(?)은 다음과 같습니다.
1. 항원의 양을 늘린다. 아무래도 막단백질이 목적하는 항원이니 양적으로 부족할 수 있습니다. 좀더 많은 양의 박테리아를 모아 lysis 후 면역침강을 수행해보면 좋을 것 같습니다.
2. 다른 종류의 detergent를 사용하면 어떨까요?
Triton X-100, deoxycholate, Sarkosyl, CHAPS 등을 사용해 보면 어떨까요? 언급한 계면활성제를 사용해 면역침강을 성공적으로 수행한, 많은 논문들이 있습니다.
3. 실험순서 중에 Protein A 레진에 항체를 먼저 붙이지 많고 free한 상태의 항체를 먼저 처리한 다음에 protein A 레진을 첨가하면 어떨까요? 저의 개인적인 생각으로 protein A 레진에 항체를 공유결합으로 고정화(immobilization)한 후, 항원시료와 반응하는 것이 가장 좋은 면역침강법이라고 믿고 있으나, 그렇지 않는 경우도 간혹 있더군요. 즉 free Ab를 처리한 다음 레진을 첨가했을 때 단백질 항원 검출이 더 성공적일 수도 있습니다.
sein und zeit님 감사합니다.
그런데요 지금 co-immunopercipitation 실험을 수행중이라서 non-ionic detergent를 사용하여 lysis를 하고 있습니다.
그런데 sarcosine, CHAPS 등은 단백질 구조를 변화 시킬 수 있다고 알고 있습니다. 그렇기 때문에 사용하지 않고 있습니다.
그리고 nonbinding fraction에서 표적 단백질이 검출 되는데 세포량을 늘려서 총 단백질 양을 늘리는게 의미가 있을까요?
웨스턴 수행시 항체를 희석하는 버퍼나 워싱 버퍼에 2% Tween-20이 포함되어 있기 때문에 NP-40이 있어도 항체 결합에는 지장이 없다고 생각합니다. 하지만 결합이 되지 않는 것으로 보아 cell lysis가 제대로 되지 않았거나 충분히 단백질 주변의 지질이 제거가 되지 않았다고 볼 수 있는 것인지요? 이렇게 생각하는 이유는 cell lysate가 매우 끈적합니다.
lysozyme를 처리하고 나서 원심분리를 해서 lysozyme을 제거를 해야하는 것인가요? 저는 제거과정 없이 NP-40을 바로 처리하였습니다.
만약 sarcosine, CHAPS 등을 사용할 때는 얼마정도의 농도를 사용해야 하는 것인지요?
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레벨5
sein und zeit
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12.08.23 15:53
1. nonbinding fraction에서 단백질을 검출하신 것은 WB 방법이라 생각됩니다. WB와 IP는 여러가지 면(실험조건, 항체의 결합력 등)에서 다르기 때문에 항원양을 늘리는 것은 충분히 의미가 있습니다. 노파심이지만 사용하고 계시는 항체가 WB와 동시에 IP용인지를 확인해 보세요. 항체를 파는 회사에서 datasheet를 함께 주는데 거기에 WB, IP, IH 등등으로 적혀 있습니다. 만일 IP라는 표기가 없다면 IP용으로 사용할 수 없고요...
2. 시간적, 혹은 실험재료(항체 등) 등에서 여유가 있으면 계면활성제를 다른 종류로 바꿔 사용해 보시면 어떨까 합니다. 앞서 말씀드린 바와 같이 다양한 종류의 계면활성제 존재하에서 IP를 성공적으로 수행한 논문들이 많이 있습니다. 제 생각에는 논문을 발표한 연구주체들이 아마 특별한 이유가 있어서 특정 계면활성제를 사용했을 것이라 생각됩니다. 그리고 다른 계면활성제에 의한 단백질의 구조변화 유도를 걱정하시는데... 실제 구조변화에 의해 IP가 잘 되는 경우는 너무 많습니다. 여기에서 구조변화는 대부분 3차 구조를 의미합니다. 만일 항체가 2차 구조 상에 존재하는 epitope를 근거로 만들어졌다면 3차 구조 변화는 오히려 도움이 될 수 있습니다. 항체가 실험동물 몸 속에서 만들어지는 과정과 기전을 생각해보면 3차 구조 상에 존재하는 epitope를 면역원성 또는 항원성으로 인식해 항체가 유도될 가능성은 상당히 낮습니다. 단지, 단백질의 3차구조 변화에 의해 단백질-단백질 상호작용(항원-항체 반응이 아닌...)에 영향을 주어 Co-IP에서 단백질 복합체(complex)를 확인하는데 문제가 생길 수는 있습니다. 그러나 이러한 가능성은 모든 계면활성제에 동일하게 적용되겠지요. CHAPS나 deoxycholate가 막단백질의 3차구조 변화에 미미한 영향을 끼친다는 논문도 많이 있습니다. 실제 세포막에는 중성(net charge가 0) 뿐만 아니라 산성(net charge가 음, 예를 들어 phosphatidylserine, phosphatidylinositol, phosphatidylglycerol, phosphatidic acid 등등) 지질들도 상당량 포함하고 있습니다.
3. Cell lysate가 끈적거리는 것은 대부분 chromosomal DNA 때문입니다. DNase를 조금 첨가하시거나 cell lysis 시 probe sonicator로 초음파를 가하면 높은 점성이 완화됩니다. 제 생각에는 세포가 덜, 불완전하게 lysis되었다고 생각하지 않습니다.
4. 두서없이 적어 정확한 답변이 되었는지 모르겠습니다. 더 궁금하신 사항이 있으시면 글 남겨주세요.