실험 Q&A Mol. Biol.-DNA > Gene Cloning
Gene cloning 관련 질문입니다.
chossa (비회원)
pET vector에 glycogen synthase라는 효소의 ORF를 삽입시켜 최종적으로 효소 발현 및 정제하는 실험입니다.
우선, ORF의 양 말단에 Nde1과 Xho1 자리를 만들어 주었습니다.
Ex taq polymerase로 PCR을 해준 후, T-Vector에 삽입시켰습니다.
위와 동일한 제한효소로 잘라준후, pET vector(Nde1. Xho로 처리됨)에 넣어줬습니다.
ligation이 된 것을 확인이 되어, BL21(DE3)에 transformation 시킨 후, T7 promotor가 작동하도록 protocol대로 IPTG를 넣어주어 배양시켰습니다.
그런데, SDS PAGE를 통해 확인해 본 결과, 이론상 55kDa에 과발현 되어있어야 하는 효소가 안나왔습니다.
기존에 cloning되어 효소가 발현된 pET21a-GBE도 위와 동일한 과정으로 선행 실험이 되어 잘 사용하고 있습니다. 그래서 위의 실험을 진행하면서 pET21a-GBE도 동일하게 Nde1과 Xho1자리를 잘라주고 다시 ligation 해 주었는데, 잘 발현이 되는것을 볼 수 있었습니다.
Nde1,Xho를 이용하여 잘라진 pET vector도 동일하고, ORF말단에 제한효소자리도 각각 동일하게 잘 만들어 주었는데, 왜 glycogen synthase는 발현이 안될까요?
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