실험 Q&A Mol. Biol.-Protein > Pull-down Assays
ubiquitination, IP관련 질문이 있습니다.
레벨5 하늘을달려라
원래 ubiquitination을 했던건 아닌데..DNA가 돌아다니길래..
제가 관심있는 protein, 편의상 A라고 하겠습니다.
A랑 Ub랑 tfx후 IP해서보니 ubiquitination이 일어나는걸 확인했습니다.
그뒤로 기본적으로, ubiquitination관련해서 논문나올때 나오는 data들 구색은 갖췄습니다.
CHX치고보니..endogenous level이 unstable하고..K48 dependent하고,
어떤 약물치니 ubiquitination이 더 증가하고, degradation도 더 증가하고..
요정도 data를 모았는데..
A라는 단백질이 나쁜녀석인지라..A의 degradation이 clinical implication이 클거같아서..
꼭 E3 ligase를 찾아주고 싶습니다..
그래서 다마콘에서 나오는 E3 ligase SMARTpool siRNA도 사볼까했는데..
600여개의 E3를 전부 스크리닝해보려면 약 2천만원정도 들겠어서..잠시생각을 접고있었는데..
다른 접근을 해보려고합니다.
먼저 좀 큰 scale로 GFP-A, HA-Ub tfx후..GFP로 IP..
그후에 elution하여 그걸다시 HA로 IP한후
2D해서 mass를...찍으면 E3를 찾을수 있을까요?
걱정되는부분은..첫번째 IP후 bead에서 elution할때..complex등이 풀리지 않을까 하는점입니다.
지금까지는 딱히 elution않고 sample buffer넣고 끓여서 바로 로딩했는데..
아이피를 두번해야겠다는 생각을하니..complex를 풀리지않은범위에서 잘 elution해야겠다는 생각이 드는데..가능한 부분일까 싶습니다.
혹시 이런 목적으로 elution하시는분 계시면 조성좀 알려주시면 감사하겠습니다.
여러모로 많은 조언과 가르침 부탁드리겠습니다.
감사합니다.
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