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ligation을 위한 gel extraction.. |
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 밍밍밍 | 2012.05.30 10:55 |
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저는 cloning을 배우고 있는 대학원생입니다
주변에 도와주는 선배가 없어서 혼자 끙끙대다가 질문합니다
먼저 restriction enzyme으로 insert(약 400bp)가 껴있는 Tvector랑
pGEX vector를 Xho1이랑 BamH1으로 double cutting 해주고
전기영동을 해서 gel extraction 했습니다.
1 marker
2 pGEX
3~5 cutting pGEX
6 Insert가 있는 Tvector
7~9 Tvector에서 insert를 cutting (희미하게 아래쪽에 보이는 것이 insert 입니다)
10 linear Tvector
2,6,10은 control이고
digestion할때는 total 20ul mixture사용하여 각 lane은 6X buffer까지 해서 24ul입니다.
DNA의 농도는 정확히 모른채로 사용해서 전기영동 후 band로 짐작 하였구요.
농도를 높이고자 각각 세개 lane을 이용해서 gel extraction 하였습니다.
extraction할때 lysis buffer를 3배 넣고 isoprophenol을 gel과 같은 양 넣어서
gel 한개 분량만 column에 넣고 centrifuge 시킨다음에 같은 column에 또 다음 lane의 gel 녹인것을 넣고 centrifuge 시켰습니다. 그래서 한 column에 세개의 gel에 있는 DNA를 추출하려하였습니다.
이렇게 gel extraction 시킨후에 260nm에서 OD 측정 결과 5ng/ul 나오네요ㅠㅠ
몇번이고 해봤는데도 extraction수율이 낮은건지 아니면 실험 방법이 잘못된건지
너무 농도가 낮게 나와서 ligation하는데 문제가 되네요...
혹시 몰라서 ligation 시킨다 해도 transformation 시켜서 보면 colony가 없구요..
comp.cell은 아무 이상이 없는거 같은데 말이죠...
너무 답답합니다ㅠㅠ
고수님들.. 문제점, 조언, gel extraction tip, ligation tip 부탁드려요ㅠㅠ |
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#gel extraction #ligation #cloning |
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