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목적이 단순한 PCR 인가요?
그러면 일부러 ssDAN로 변성시킬 이유는 없습니다.
PCR 첫 단계에서 DNA는 다 denaturation되거든요.
hairpin 구조는 간혹 PCR에 영향을 미치기는 하지만 대부분의 경우 아무 영향이 없습니다.
두가닥 DNA에서 각각의 가닥을 분리해서 다른 tube로 옮기는것이라면 방법이 없지는 않으나 번거롭습니다.
예전에는 (G+C)%가 높아서 PCR이 되지 않는 DNA를 1M NaCl 용액에 담가서 변성시킨 후 3M NaAcetate 를 1/10 부피만큼 넣고 EtOH ppt를 시키면 ssDNA 상태를 유지할 수 있다고 해서 그런 방법을 사용하기도 했었습니다.
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엘피스바이오텍
(비회원)
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12.05.19 14:33
Single stranded DNA를 얻는 방법은 아주 많습니다.
우선 만드는 방법은 PCR을 이용한다고 하셨으니 이부분은 생략하기로 하고,
dsDNA와 ssDNA를 분리하는 가장 간단한 방법은 제한효소를 이용하는 것입니다. 제한효소는 ssDNA는 자르지 못합니다. MboI과 같이 4base제한효소를 사용하거나 또는 6base 효소라도 중간정도에 위치해 잘랐을때 dsDNA만 잘려 ssDNA와 size면에서 구분되기만 하면 됩니다. 그런 후 gel elution을 하면 됩니다.
만약 plasmid vector를 잘라 이를 template로 한방향 PCR을 한다면 얘기는 더 간단해 집니다. 만들어진 ssDNA는 dsDNA와 size면에 있어서 확연한 차이를 가지게 됩니다. 그냥 elution을 해서 사용해도 되며, 아니면 DpnI을 처리하여 plasmid template를 제거한 후 사용하는 방법을 쓸 수도 있습니다.
더 복잡한 방법으로는 ssDNA binding protein이나 또는 dsDNA binding protein을 이용하는 방법이지만 이러한 단백질들이 가용하지 않다면 쓸 수 없는 방법입니다. '
PCR을 이용하는 방법은 한 cycle에 한 copy가 더 만들어지므로 애초애 많은 양의 template를 사용하지 않는한 넉넉한 양의 ssDNA를 얻기란 좀처럼 쉽지 않습니다. 더 좋은 방법은 T7 promoter를 앞에 달아놓고 T7 RNA/DNA polymerase를 이용하고 dNTP를 기질로 사용하여 ssDNA를 합성하는 것입니다. 원해 T7 RNA pol은 NTP를 기질로 RNA transcripts를 만드는 효소이지만 변형된 T7 R/D polymerase가 있는데 (어딘지는 찾아봐야 겠지만 파는 곳이 있습니다) 이는 dNTP를 기질로 사용할 수도 있는 효소입니다. 10ng의 template만 사용해도 1시간이면 ug단위의 ssDNA를 충분히 얻을 수 있을 겁니다.