클로닝에서 뭐 몇 람다.... 이런 정보는 의미가 없습니다.
벡터 몇 kb 짜리 몇 ug, 인서트 몇 kb 짜리 몇 ug 정보가 필요합니다.
왜냐하면 클로닝은 벡터와 인서트의 분자수의 비로 결정되기 때문입니다.
또한 콘트롤이 없으면 어느단계에서 문제가 있는것인지를 파악할 방법도 없습니다.
여기서 클로닝, 라이게이션 등의 키워드로 검색하시면 어떤 콘트롤이 필요한지, 어느정도의 DNA를 사용해야하는지, 벡터 인서트의 분자수 비율은 어떻게 해야하는지의 정보를 얻을 수 있습니다.
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석사신입
(비회원)
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12.03.08 11:23
강시님 감사합니다.
가르쳐주신 검색어로 좀 더 공부해보겠습니다!
Remove the phosphate group in the 5400 bp vector by alkaline phosphatase.
This will eliminate self-ligated products.
Double digestion이 아닌 single digestion이니 당연히 alkaline phosphatase를 쳐야합니다.
아니면 당연히 self만 잔뜩나오죠.
만약 실수로 CIAP 처리 했던 내용을 누락하신게 아니라면 이런 내용들은 sub-cloning에 너무나도 당연한 과정이라 두 달이나 시간을 보내신 상황이 참 안타깝습니다.
실험 초보이시고 사수도 있다고 하시고 학교라면 교수님도 계실텐데 이를 알려주지 못한 상황도 그리고 molecular cloning만 봐도 알 수 있는 문제를 잡아내지 못한 상황도 아쉽네요.
실험을 그냥 열심히 하면 된다고 생각하지 마시고 문제를 해결하기 위해 많은 방법을 찾아보세요.
요즘처럼 정보를 얻기 쉬운 세상에서 이러한 문제점은 스스로 노력하면 금방 잡아낼 수 있습니다.
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석사신입
(비회원)
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12.03.08 13:10
사수 언니는 굉장히 열심히 도와주셨는데..ㅠ_ㅠ
아무튼 인산기 떼는 시약은 현재 실험실에 없어서 안 사는 방향으로 해보고자 했었습니다..ㅠㅠ
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석사초짜
(비회원)
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12.03.08 13:13
CIAP 하나 사세요...아니면 옆방가서 쫌만 빌리던지
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석사초짜
(비회원)
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12.03.08 13:16
상식적으로 CIAP 처리안하고 single cut cloning하는건 거의 불가능한게,
vector의 self-ligation은 intramolecular reaction이라 insert-vector의 intermolecular reaction에 비해 월등히 잘 일어납니다. CIAP 없이 클로닝을 하시려면 차라리 enzyme 2개를 쓰는게 어떨까요?
Prep은 qiagen kit로 하시는것으로 봐서는 실험실 연구비가 너무 없는 상황도 아닐텐데 그리고 CIAP가 그렇게 비싼것도 아닌데 일부러 어려운길로 가면서 노동력으로 해결하자는 것은 매우 잘못된 방향인 것 같습니다.
제가 올린 답글을 보니 좀 죄송스런 마음도 생깁니다.
그저 안타까운 마음에 올린 글이니 기분 안 상하셨으면 좋겠네요.
실험 잘 되실거라 믿겠습니다.
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레벨5
propadrum
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12.03.09 01:46
한 가지더,, 하나의 enzyme으로 클로닝 하시면, 앞뒤가 바뀔 수도 있으니,
반드시 sequencing이나, 중간에 다른 enzyme을 사용하여, 정방향으로 들어갔는지 확인하셔야 해요^^
윗분들 말씀대로 CIAP를 꼭 사용하시구요~
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레벨5
propadrum
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12.03.09 01:47
원본 벡터에 EcoRI으로 되어있다면,
그 부위를 다시 PCR하는 방법이 있습니다, 이때는 EcoRI과 다른 enzyme을primer에 붙이셔야 겠죠^^
차라리 이 방법이 하나의 enzyme으로 클로닝 하는 것보다 수월할 듯 합니다^^
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석사신입
(비회원)
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12.03.10 11:52
답변 해주신 분들 모두 감사합니다.
모든 분들 실험이 잘 되길 바랍니다!