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 전체 > Molecular Biology-Protein > Western Blot Analysis
조회 3289  스크랩 인쇄하기 주소복사 트위터 공유 페이스북 공유 
질문 엘피스님..western 관련 질문있습니다
넌western운명  | 2005.05.24 00:00
답변있는 질문은 수정/삭제 불가(☞문의)
앞서 많은 분들의 글에 달린
님의 해박한 지식과 상세하고 친절한 답변을 읽으면서
평소 궁금했던 부분들에 대해 많은 가르침을 받았습니다
그래서 저도 질문을 드릴까합니다^^
western negative control에 대한 검색을 하던중
예전에 누군가의 답변을 써주신 글중에
"사용했던 blocking solution과 항체는 -20C 에 보관하며 수차례 재사용이 가능하다 (항체 가격이 워낙 비싸서!!!)"
라는 말이 있던데
5% milk에 넣은 primary,secondary antibody도 reuse가 가능할까요?
물론 냉장(4도씨)보관해서요
(저희 실험실에서는 primary Ab를 reuse하기 위해 보통 5%milk는 안넣거던요..
워낙비싸서!!!^^;)
-20도씨에 보관하다가 이용시에는 그냥 얼음에 놓고 천천히 녹이면 되나요?

그리고 stripping시에 0.2M NAOH를 이용한 방법이 있던데
시간은 얼마나, 몇도에서 하나요?
2-mercaptoethanol을 쓰는 것보다 왠지 편할꺼같아서요 헤헤^^;

그리고 positive와 negative control을 걸려고 하는데요
positive는 논문seach를 통해 찾았는데
negative는 보통 어떻게 하는지 모르겠습니다
western 초보라 이것저것 모르는게 많고 물어볼데도 마땅치않네요

많은 변수가 있는 실험중에 하나가 western이라지만
너무 어렵고 힘드네요 궁시렁궁시렁
암튼 답변이 기다려집니다
다른 실험고수분들의 답변도 부탁드립니다^^

#western
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
엘피스  |  2005.05.24    
Skim milk는 4C에서도 쉽게 상합니다. 방부제를 넣으면 좋긴 하지만 흔히 쓰는 방부제 (대표적으로 sodium azide)들은 peroxidase의 강력한 억제제들이라서 이도 좋은 방법은 아닙니다. Alkaline Phosphatase는 sodium azide에 영향을 받지 않으므로 보관이 훨씬 수월합니다.

-20C에 보관시 최소 4-5회 정도는 반복해 사용할 수 있습니다. 얼음위에서 녹이는 것은 녹는데만 며칠 걸리므로 상온에 놔두거나 아니면 흐르는 수돗물에 담가두면 됩니다.

제가 peroxidase의 활성을 방해하지 않으면서 방부효과를 가지는 조성을 알고 있어 이를 상품화하려 했으나 반응이 시큰둥하여 아직 제품으로 내놓지는 않고 있는데 혹 출시하면 장사가 될까요?

두번째로 NaOH를 이용하는 방법은 적절치 못하고 pH2의 Glycin buffer를 사용해 보세요. 항체/항원 결합이나 항체/ProteinA결합을 뗄때 쓰는 buffer라 효율은 좀 떨어지지만 일단 b-ME의 냄새를 피할 수 있어 좋을 겁니다.

세번째로 western에서 사실 negative control은 크게 필요가 없습니다. 우선은 siganl이 size정보와 함께 나타나고, 있느냐 없느냐가 positive control하나로 모두 보여지기 때문입니다. 굳이 Control이 필요하다면 발현이 않되는 조직이나 cell을 로딩하거나 extract를 항체로 precleaning하여 사용하시면 됩니다. Immunoprecipitation으로 잡고자 하는 항원단백질만 쏙 빼버리는 것이죠.

넌western운명  |  2005.05.24    
pH2 Glycin buffer의 농도는요?
그리고 glycin buffer에는 얼마나 두어야 할까요?

그리고 혹시 그 상품에 대한 제 생각을 물으신 거라면^^;
짧은 제 생각으로는..
그 방부효과있는 solution에 대한 아이디어는 좋은것 같아요
하지만 여러번 reuse하다보면 처음보다 지저분해질수 있을테고,
western 결과에 어떤 영향도 미치지 않는단 것등의 염려까지 검증되어
적절한 홍보가 이루어진다면 정말 대박감같은데요?^^
저도 하나 사겠습니다^^

암튼 감사합니다
오늘도 하나 배워갑니다~~^^
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