RIPA buffer로 protein sample을 얻고 4x sample buffer를 넣었습니다. 그리고 95도 boiling을 하고, pcr tube용 centri를 돌렸습니다. sample양은 4x sample buffer를 넣고서도 10ul가 안 되었습니다. 그리고 protein함량은 50ug이었구요.
이러한 상황에서 western sample loading시 aggregation이 생겼네요 그래서 loading할 때 1x buffer를 5ul를 더 넣고 pipetting으로 풀어주려고 하는데도 aggregation이 잘 풀리지 않았고 well에 조그만 조각들이 들어가네요 ㅜㅠ pipetting을 잘 해서 잘 풀어주면 되겠지만 애초에 aggregation이 안 생기도록 하고 싶어서 aggregation이 왜 생겼는지 궁금합니다. 선배 실험자 분들은 이럴 때 어떻게 대처하는지 궁금합니다.
------------------------------------------------------------------ 상황을 추가하였고 제생각에는 적은 sample양비 높은 농도이거나 centri 때문이지 않을 까 싶은데 어떻게 생각하시나요?
Concentrations of proteins looks too high. Further dilute the samples to the final conc. ~ 1~2 ug/ul. And boil the sample in the boiling water not in the PCR machine.
I have one question. Did you remove the insoluble fraction after lysis by RIPA buffer?
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