marker가 western blot용 (원래 목적이 필름에 현상되는 marker)가 아니고 단지 pre-stained maker 라면 antibody는 이를 잡으면 안됩니다. 그런데도 잡는 다면 이는 antibody의 정제도가 많이 떨어지거나 titer를 잘못 잡았을 때 발생하는 일입니다.
폰슈로 band를 확인하는 것은 단지 transfer가 고르게 이루어 졌는가를 확인하기 위한 것이지 내가 보고자 하는 단백질이 잘 넘어왔는 가를 보려는 것이 아닙니다. 폰슈의 염색정도는 흔희 실험실에서 사용하는 단백질 염색법 중에서도 가장 떨어지는 민감도를 갖습니다. 한마디로 band당 염색되는 놈보다 안돼서 안보이는 놈이 많다는 말이죠. western은 폰슈보다 100000배 이상의 민감도를 갖는 실험 법입니다. 따라서 폰슈로는 내 단백질이 넘어왔다 넘어오지 않았다를 판단하는 것이 아니라 transfer가 고르게 이루어졌다, 이루어지지 않았다는 판단하기 위한 목적입니다.
fixer의 경우는 까매지건 말건 떨어질 때 까지 쓰시면 되고, developer의 경우에는 band의 두께는 예전과 별반다르지 않는데 해상도가 떨어진다 싶으면(이건 대번에 알아볼 수 있습니다. 많이 흐리게 보이니까요)새로 만들어 사용해야 합니다. 이는 노출시간과 band강도에 영향을 줍니다.
stripping을 할경우에는 antibody뿐 아니라 transfer된 단백질도 일정 비율로 같이 떨어져 나갑니다. 그래서 target단백질이 많지않을 경우에는 stripping할때 마다 점점 약하게 나타나는 것은 어쩔 수 없는 현상 입니다.
결론 적으로 가장 의심이 가는 님의 문제는 antibody의 문제이거나(antigen보다 이것 저것을더 잡아버리는), target이 없거나 이 두가지로 생각해 볼 수 있습니다.
이것은 현 질문에서 예상되는 문제이지 절대적인 문제는 아닙니다. western은 간단 하다가도 한번 막히기 시작하면 모든 것을 의심해가며 문제를 찾아가는 실험이기에 그렇습니다. 하다못해 전선까지도 의심을.............
며칠간 비슷한 질문이 올라오는데
웨스턴 셋업 때문에 고생을 하시는거 같네요.
일단 타겟 단백질이 뭔지 모르겠으나 그것으로 셋업을 하려고 하지 마시고.
(왜냐하면 회사마다 안티바디 성능이 제 각각이며 현재 어떤게 문제인지 갈팡 질팡하고 있기 때문입니다.)
반드시 나오는 항체로 조건을 잡고 시작하십시요.
예를 들면 베타 엑틴 같은 항체가 있겠죠. 하우스키핑 단백 항체 같은 경우는 대부분 잘 잡습니다.
지금 타겟 단백이 없는건지, 이씨엘이 문젠지, 리블랏팅이 문젠지, 블락킹이 문젠지, 안티바디가 문젠지, 디벨로퍼나 픽서가 문제인지 안티바디 희석비율이 문제인지 갈팡질팡 하잖아요.
일단 조건을 픽스해놓고나서 맞춰가면 됩니다.
제안
1. 조건 잡을시엔 모든 솔루션과 메테리얼을 프레쉬한걸 사용합니다.
2. 안타바디는 베타 엑틴 같은걸 사용합니다. (아마 가격은 저렴할 것입니다.)
3. 트랜스퍼까지는 문제가 없는거 같습니다.
4. 하나씩 픽스하고 뭔가 잘 나온다 싶을 때 타겟단백을 잡기 바랍니다.
혹시 ECL Contamination 된 건 아닌지...
아 감사합니다. 제가 아파서 어제 랩을 못 나와서 지금 올리네요. 그런데 제가 target 단백질을 보려고 한 게 아니라, reference 18s rRNA에 대해서만 계속 western blot을 해보고 있었어요. 저도 조건부터 잡고 싶어서요. Antibody도 계속 fresh한 걸로 사용하고 있어요. 심지어 washing하는 용액도 새로 만들어 쓰고 있고요.
친절하신 답변들 감사하고요, 우선은 fresh한 developer로 다시 해보려고 해요. 고민인게 현상이 됐다 안됐다 하는 점이랑 (ECL이 빛이 날 때가 있고 안 날때가 있는 것 같아요.) 현상이 되도 밴드가 너무너무 희미하다는 거죠. 그런데 또 이상한게 폰슈로 볼 떄는 밴드가 선명하게 보였고, 제가 넣어준 단백질 양도 그렇게 적지는 않거든요. 세포를 모아서 cocktail+RIPA buffer 50람다로 lysis했어요.
예전에 글 올라온 거 보니 overnight으로도 exposure해봤다고 해서 저도 오늘은 그렇게 해보려고요.
도움 주셔서 정말정말 감사합니다.
아 참, 희석 비율도 1차는 500배와 2차는 1000배로 하고 있어요. 낮은 농도는 아니잖아요. 밤에 잘때도 생각하고 샤워할 때도 생각하는데 잘 모르겠네요 ㅎ
일단 조언해 주신 건 다 돌려보고 다시 생각해봐야겠어요. 다시 한번 감사드립니다;;;;;