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 전체 > Molecular Biology-RNA > Purification/Isolation
조회 10328  스크랩 인쇄하기 주소복사 트위터 공유 페이스북 공유 
질문 gel extraction 문제
급급함  | 2012.01.09 19:06
답변있는 질문은 수정/삭제 불가(☞문의)
첨부파일 파일첨부: gel extraction.jpg (19 KB)
이미지 첨부파일
제가 PCR 후 gel extraction 을 수행하고 있는데 gel extraction 후 DNA가 없어집니다.
어느 단계에서 문제가 있나 모르겠는데 3~4번 정도 실험을 수행했음에도 계속 같은 결과가 나옵니다. gel extraction kit가 문제가 있나해서 제품을 바꿔봐도 결과는 똑같네요.
PCR결과와 gel extraction 후 결과를 첨부합니다.
선배님들의 의견 부탁드립니다.
size는 2kbp 정도 됩니다.
#PCR
 
#Gel extraction
답변하기
답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리강시  |  2012.01.09   
젤 사진을 보면 님은 젤에 너무 과다한 양의 DNA를 loading하는 경향이 있습니다.
마커의 경우, 사진의 1/5만 loading해도 충분합니다.
과다항 양을 loading하면 마커 밴드가 떡처럼 뭉쳐서 DNA 밴드의 크기를 알 수 없습니다.
이런 젤 사진은 있으나 마나입니다.

extraction과정은 kit에서 설명한 대로 하셨겠죠?
특히 gel조각의 무게와 solubilization 용액의 비율은 잘 맞추셨겠죠?
사진을 보면 DNA 밴드의 두께가 굉장히 두꺼운데 젤 조각이 최소한 1-2 그람은 되겠네요.

kit는 사용이 간편하지만용법을 제대로 지키지 않으면 결과가 엉망이 됩니다.

한가지 추천할것은 PCR 후에 일부를 젤에 걸어서 잡밴드가 없는지 확인하시고, 잔밴드가 없으면 PCR purification kit를 사용하세요.
님의 젤사진의 경우처럼 깨끗하고 양이 충분할 경우라면 젤 extraction을 할 이유가 없습니다.
개구리당근시른토끼  |  2012.01.09   
강시님의 답변들은 항상 도움이 되고 있습니다.
하지만 gel extraction kit에서 사용되는 gel lysis buffer의 양과 gel 무게는 그냥 참고사항 일뿐 DNA가 없어지는 결과는 되지 않을 것 같습니다. Loss가 일어날지언정..

Gel extraction 후 DNA가 아예 없어지는 현상은 contamination이 될 확률이 높아보입니다. 아니면 kit를 잘못사용하고 있을지도 모르겠네요.. extraction kit의 종류와 사용하신 method를 간략하게 적어주시는게 답변에 도움이 될 듯 합니다.
급급함  |  2012.01.10    
일단 PCR 후 메인 타겟만 정제할려고 gel extraction을 수행했고(사진에는 보이지 않지만 잡밴드들이 꽤 많음) 거기에 부수적으로 final vol.을 줄일려는 목적도 있었습니다.
그리고 사용한 kit는 geneall 제품이고 protocol은 gel 잘라내서 무게의 3배 볼륨으로 gel buffer을 넣고 60도에서 gel이 완전히 녹을 때 까지 녹입니다.
그리고 spin column에 옮기고 센돌이 돌리고 빠진놈은 버리고 워싱버퍼 넣고 센돌이 돌리고 빠진놈 버리고 추가적으로 센돌이 돌려서 남은 워싱버퍼 완전 제거 후 elution buffer 넣고 1분간 방치 후 센돌이 돌려서 elution합니다.
개구리로소  |  2012.01.10   
가운데에 길게 내려 오는건 마커인가요..????

일단 gel 상태가 이상한것으로 보아..이것도 수정해야 되실거 같습니다...

같은 회사 키트를 쓰고 계시는데...

제가 쓰는 메뉴얼은

gel 무게의 3배 GE buffe 넣고

50도 에서 10min. 하는 중간 중간 꺼내서 좀 더 잘 녹게  위아래로 믹스시켜줍니다.

컬럼 튜브에 옮긴후 1min 원심분리, 내려 나온 액은 버리고

NW buffer 700 넣고 30초간 원심분리 이후 버리고, 1min간 더 원심분리 이후

새 e-tuve에 컬럼을 끼운후

DW(or TE 넣고) 10~20초간 두었다가, 1min 간 원심분리합니다.
개구리당근시른토끼  |  2012.01.10   

Gel extraction은 그다지 어려운 실험이 아니니 문제점을 파악하기가 더욱 힘이 드는 것 같습니다. target size를 알고 있으니 좀 귀찮으시더라도 gel상에서 band가 보이지 않더라도 TA ligation후 Ligation product를 template로 하여 PCR을 걸어보시는게 가장 좋을 듯 합니다. 저의 경우에 50ul elution buffer로 eltuion한 후(보통 1/5정도 영동합니다) 5ul를 영동하였는데 band가 보이지 않는 경우가 있었습니다. 그래서 ligation에 필요한 최소한의 양만 남기고 나머지를 전부 영동하여 겨우 band가 살짝 보여서 TA Ligation을 한 후에 확인을 하였습니다. 결과는 잘 되었구요. TA Ligation은 많은 시간을 필요로하지 않으니 믿져야 본전인셈 치고 한번 해보시길 권장합니다.

급급함  |  2012.01.11    
답변들 모두 감사합니다.
저도 protocol에는 문제가 없을 것으로 보았는데 뭐가 문제인지 도저히 감이 없어 질문을 한 겁니다. 문제는 kit 자체 문제였던 것 같습니다.
업체에서 샘플로 받은 kit로 새로 수행해 본 결과 gel extraction이 무리없이 잘 수행되었네요.
가지고 있는 kit은 버려야 겠어요.
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