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 전체 > Molecular Biology-DNA > PCR/RT-PCR/Q-PCR
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질문 Single blastocyst 샘플을 이용한 qRT-PCR
알Gno  | 2012.01.04 21:24
안녕하세요~ 
저는 대학원 박사과정생입니다.

요즘 저는 돼지의 single blastocyst에서 RNA를 추출하여 qRT-PCR을 시도하고있는데요,
아무래도 cell number가 부족해서인지 결과가 잘 안나오네요.

전 Qiagen RNeasy Micro Kit으로 RNA 뽑아서 Sensiscript Kit으로 cDNA 합성한 다음에 Roche SYBR green Kit으로 real-time 돌리고 있습니다.

근데 reference gene으로 사용하는 beta actin은 완전 말끔하게 뜨는데, 제가 볼려는 다른 gene은 잡히지가 않네요.

melting curve를 보면 피크가 오르는 것이, 분명히 뭔가 있는거 같거든요.
primer는 다른 cell line에서 PCR 내려서 검증은 확실히 된거구요, 

아무래도 제생각은 역시 샘플 양이 적어서 그런 것 아닌가 하고 있습니다.
특히 돼지 single blastocyst는 cell number가 50개 내외거든요.

그래서 one-step qRT-PCR kit도 고려해봤는데 invitrogen 사이트에 보니 종류가 꽤 많네요.
혹시 one-step kit을 써보신 분 계시면 좀 추천 부탁드립니다.
그리고 다른 고려사항이 있는지, 조그만 정보라도 알고계시면 좀 알려주시길 부탁드립니다.

추운날씨에 감기 조심 하시구요 ^^
#qRT-PCR
 
#real-time pcr
 
#blastocyst
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
알이효바이오  |  2012.01.05   

저희 이효바이오에서 취급하는 Kapa 브랜드의 SYBR kit를 사용해보시는것을 권해드립니다.
Roche 기기 전용 SYBR kit와, Roche 기기 전용의 one-step SYBR kit 모두 제품이 나옵니다.
one-step SYBR kit 사용시, total RNA양을 1pg~100ng으로 사용하는것을 권장합니다.
일반 SYBR kit와 one-step SYBR kit 샘플 무료로 신청 가능합니다. (두 제품 샘플 모두 30rxn)

이효바이오. T. 02-443-2382

개구리막장인생  |  2012.01.06   
음..그런것보단
먼저 blastocyst에서 발현이 확실히 되는지부터....보시는게..
다른 쏄라인은 말그대로 다른 조직일뿐 .....
뭐...실험들어갔으니 충분히 고려 했다고 보긴 하겠지만....
아님 쎌양이 적어서 그럴수도 있겠습니다..
하지만 PCR 원리상 싸이클만 충분히 올려도 충분하하다고 생각되고요....
차라리 taqman을 써보세요... onestep이라고 별다르진 않습니다..오히려
초기쎌양에 따라서 통째로 RNA를 뽑는것이기에..
컨트롤과 ddCT의 차이가 심해져서 못쓰게 될경우가 더 많습니다.

수고하시구요~~
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