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pcr고수님들 알려주세요ㅜㅠ |
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답변있는 질문은 수정/삭제 불가(☞문의) |
안녕하세요
몇달째 pcr이 안되서 고생하고있는 학생입니다ㅠㅜ
코멘트라도 얻고싶어서 올립니다.
저는 바이오제닉아민 즉 histidine decarboxylase gene과 tyrosine decarboxylase gene을
검출하고자 pcr을 하고잇습니다.
균주는 Bacillus subtilis나 licheniformis, amyloliquefacience 균주들입니다.
청국장에서 분리해낸 균주들이죠
정색반응을 통해서 histidine decarboxylase과 tyrosine decarboxylase 을 활성이 있다는 것을
확인하고 각각 primer를 이용하여 pcr을 하고있죠
논문에서 참조하여 쓰는 primer이며
논문에서 나온 조건은
first denaturation 95도 5분
denaturation 95도 45초
annealing 48도 45초
extention 72도 2분
final extention 72도 5분
이렇게입니다. 하지만 이렇게 했을때 ladder처럼 잡밴드가 엄청나왔으며
그래서 annealing온도를 높여보기도하고 primer농도도 20pmol, 2pmol로도 해보고
template도 희석도 해서 해보면
극과극입니다. 나올때는 ladder처럼 엄청나오고 안나올때는 하나도안나오고ㅠㅠ
48도 50도 52도 54도
   
target size는 435bp입니다.
잡밴드가 많아서 그냥 그런건지 모르겠지만 그위치에 band가 있긴있는것같습니다.
DNA가 손상됐는지 볼라고 전기영동해본결과 절단되거나 그런 현상은 없었구요
지금 사진은 annealing온도만 바꾼거 올렸는데
primer농도 바꿔서했을때도 저런 양상입니다.
그리고 제가 사용하고있는 ladder는 1500bp짜리인데
그위에 생기는 저 band들은 뭘까요
전에했을때 잡밴드가 많이 나오긴했어도 1500bp이상에는 안생겼었는데ㅠ
미치겠습니다
도와주세요 ㅠㅜ
어떤 걸 더 설명을 해야할지 몰라서 일단은 이렇게만 올리겠습니다
답변에 필요한 설명이 있다면 말해주세요ㅠ
감사합니다^^ |
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target이 435bp 이면 extension을 굳이 2분 동안 하지 않으셔도 될 것 같습니다.
30초만 주어도 충분합니다.
그러면 긴 사이즈의 잡밴드들이 줄어들 것 같습니다.
그리고 약 435bp 밴드가 나오고 있는 것 같은데 그 부분을 확인해보시는게 좋을 것 같습니다.
PCR의 목적이 무엇인지 잘 모르겠는데 elution해서 sequencing 해보시면 될 것 같습니다.
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primer를 바꿔 보시길 강력히 권해 봅니다. |
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 플로터 | 2011.12.28
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논문에 나와있는 프라이머라도 문제가 있을수 있습니다...
직접 디자인해서 프라이머 제작해보세요...
경험도 늘고 여러가지 공부가 될수 있습니다... |
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 egomaniac | 2011.12.28
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사용하시는 Taq을 HOT Taq으로 바뀌보세요. |
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답변달아주셔서 감사합니다.
primer도 다른 primer로 사용해서 해봤는데..
그것또한 안나오더군요ㅜㅠㅜㅠㅜㅠㅜㅠㅜㅠㅜ
그래도 몇가지 팁을 얻어서 기분이 좋네요
한번 진행해보도록하겠습니다^^^^^^^^^^^^^ |
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당근시른토끼 | 2011.12.28
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우와 정말 많이 나왔네요.. 윗분 말씀데로 primer를 새로 제작해야할 것 같습니다. 그리고 현재 쓰는 primer의 길이가 몇 mer인지는 모르겠지만 길이를 좀 늘려야 할 것 같네요. primer의 교체가 정답인 것 같습니다. |
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연구동 | 2012.01.03
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만약 primer 를 바꾸는게 여의치 않다면 Tm gradient로 온도 설정을 다시 setting 해보심이 어떨런지... |
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4355bp니 Taq쓰면 extension time은 30s도 충분합니다.
ladder처럼 나오면 primer 바꾸는게 최고죠. 같은 site면 길이 늘여도 별 소용없습니다.
바꾸는게 안된다면 hot start type 쓰시면 많이 줄죠.. |
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 SPEED
 RBR
 영업새내기
초보원생
 착한사람
 척척석사_
밍고
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착한사람
 식스센스
Daegu*
빛초롱
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닥눈삼
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실전 실험 프로토콜 101
후배에게 주고 싶은 면역학 노트
