[DEBUG-WINDOW 처리영역 보기]
즐겨찾기  |  뉴스레터  |  오늘의 정보 회원가입   로그인
BRIC홈 실험
이엔셀
배너광고안내
이전
다음
스폰서배너광고 안내  배너1 배너2 배너3 배너4
BioWave  Vol.25, No.2 (2023년 2월) 오픈
전체보기 안전점검 LABox
 전체 > Microbiology > Lichen
조회 6758  스크랩 인쇄하기 주소복사 트위터 공유 페이스북 공유 
질문 pcr고수님들 알려주세요ㅜㅠ
학생  | 2011.12.27 21:27
답변있는 질문은 수정/삭제 불가(☞문의)
안녕하세요
몇달째 pcr이 안되서 고생하고있는 학생입니다ㅠㅜ
코멘트라도 얻고싶어서 올립니다.

저는 바이오제닉아민 즉 histidine decarboxylase gene과 tyrosine decarboxylase gene을
검출하고자 pcr을 하고잇습니다.
균주는 Bacillus subtilis나 licheniformis, amyloliquefacience 균주들입니다.
청국장에서 분리해낸 균주들이죠

정색반응을 통해서 histidine decarboxylase과 tyrosine decarboxylase 을 활성이 있다는 것을
확인하고 각각 primer를 이용하여 pcr을 하고있죠

논문에서 참조하여 쓰는 primer이며
논문에서 나온 조건은
first denaturation 95도 5분
denaturation 95도 45초
annealing 48도 45초
extention 72도 2분
final extention 72도 5분
이렇게입니다. 하지만 이렇게 했을때 ladder처럼 잡밴드가 엄청나왔으며
그래서 annealing온도를 높여보기도하고 primer농도도 20pmol, 2pmol로도 해보고
template도 희석도 해서 해보면
극과극입니다. 나올때는 ladder처럼 엄청나오고 안나올때는 하나도안나오고ㅠㅠ

          48도                             50도                         52도                                54도 


target size는 435bp입니다.
잡밴드가 많아서 그냥 그런건지 모르겠지만 그위치에 band가 있긴있는것같습니다.

DNA가 손상됐는지 볼라고 전기영동해본결과 절단되거나 그런 현상은 없었구요
지금 사진은 annealing온도만 바꾼거 올렸는데
primer농도 바꿔서했을때도 저런 양상입니다.
그리고 제가 사용하고있는 ladder는 1500bp짜리인데
그위에 생기는 저 band들은 뭘까요
전에했을때 잡밴드가 많이 나오긴했어도 1500bp이상에는 안생겼었는데ㅠ
미치겠습니다
도와주세요 ㅠㅜ

어떤 걸 더 설명을 해야할지 몰라서 일단은 이렇게만 올리겠습니다
답변에 필요한 설명이 있다면 말해주세요ㅠ
감사합니다^^
#pcr
 
#BA
답변하기
답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
pcr  |  2011.12.28    

target이 435bp 이면 extension을 굳이 2분 동안 하지 않으셔도 될 것 같습니다.
30초만 주어도 충분합니다.
그러면 긴 사이즈의 잡밴드들이 줄어들 것 같습니다.
그리고 약 435bp 밴드가 나오고 있는 것 같은데 그 부분을 확인해보시는게 좋을 것 같습니다.
PCR의 목적이 무엇인지 잘 모르겠는데 elution해서 sequencing 해보시면 될 것 같습니다.

영어로땡큐  |  2011.12.28    
primer를 바꿔 보시길 강력히 권해 봅니다.
개구리플로터  |  2011.12.28   
논문에 나와있는 프라이머라도 문제가 있을수 있습니다...
직접 디자인해서 프라이머 제작해보세요...
경험도 늘고 여러가지 공부가 될수 있습니다...
알egomaniac  |  2011.12.28   
사용하시는 Taq을 HOT Taq으로 바뀌보세요.
학생  |  2011.12.28    
답변달아주셔서 감사합니다.

primer도 다른 primer로 사용해서 해봤는데..
그것또한 안나오더군요ㅜㅠㅜㅠㅜㅠㅜㅠㅜㅠㅜ

그래도 몇가지 팁을 얻어서 기분이 좋네요
한번 진행해보도록하겠습니다^^^^^^^^^^^^^
개구리당근시른토끼  |  2011.12.28   
우와 정말 많이 나왔네요.. 윗분 말씀데로 primer를 새로 제작해야할 것 같습니다. 그리고 현재 쓰는 primer의 길이가 몇 mer인지는 모르겠지만 길이를 좀 늘려야 할 것 같네요. primer의 교체가 정답인 것 같습니다.
알연구동  |  2012.01.03   
만약 primer 를 바꾸는게 여의치 않다면 Tm gradient로 온도 설정을 다시 setting 해보심이 어떨런지...
연구원  |  2012.01.03    
4355bp니 Taq쓰면 extension time은 30s도 충분합니다.
ladder처럼 나오면 primer 바꾸는게 최고죠. 같은 site면 길이 늘여도 별 소용없습니다.
바꾸는게 안된다면 hot start type 쓰시면 많이 줄죠..
답변하기
할인행사/신제품신기술 광고 검색광고
마크로텍 마크로텍
현미경 전문회사 마크로텍! 새봄맞이 현미경 마이크로톰 특가판매~!! (3.31까지)
필코리아테크놀로지 필코리아테크놀로지
GFP보다 강한 fluorescence signal : NEB SNAP&CLIP tag protein lab..
바이오닉스 바이오닉스
[TECAN No.1 한국공식대리점] TECAN 신년 행사! 견적 및 Demo 신청시 상품권 지급 (4.9까지)
필코리아테크놀로지 필코리아테크놀로지
파격적인가격 Personal Western Blot Imager 장비 Azure chemiSOLO (12.31까지)
모아바이오 모아바이오
[AFG Scientific] *새해맞이* 20% 특가 할인 프로모션! 2만가지이상의 모든 ELISA Kit.. (2.28까지)
필코리아테크놀로지 필코리아테크놀로지
효율적인 Genome Editing의 필수조건은?
최근등록   더보기 >
DNA sequencing 결과에 관해 문의드립니다   02.09
ss배지에서는 그람양성균 안자라는 거 맞죠? 자꾸 포도상구균이 자랍니다ㅠ   02.09
ELISA dilution 결정..   02.09
대장암 모델의 대장 위치에 따른 차이   02.08
(아미노산 코돈표)이 table은 왜 이런식으로 표기한건가요..?   02.08
qRT-PCR , triplicate(replicate)에 대해서   02.08
인체에서 환원이 미치는 영향   02.08
항생제 농도&종류 고민입니다   02.08
Tet on 에서 Doxycycline 처리 조건에 대해 문의드립니다   02.08
식물 에탄올추출후(전) 엽록소제거방법   02.08
최근답변자 우수답변자
대왕개구리SPEED

뒷다리RBR

알영업새내기

알초보원생

꽃개구리착한사람

올챙이척척석사_

알밍고

알jaehunjeon..

꽃개구리착한사람

개구리식스센스

개구리Daegu*

개구리빛초롱

개구리Marine

개구리닥눈삼

개구리A'ANE

개구리propadrum

실험관련연재
세오 연재중실전 실험 프로토콜 101
세오 (필명) (Cincinnati Children’s Hospital Medical Center)
곽민준 연재중랩노트
곽민준 (POSTECH 생명과학과)
신코 연재중분석장비 이야기
분석장비 탐험가 (필명) ((주)신코)
박은총 연재마감후배에게 주고 싶은 면역학 노트
박은총(Duke University)
Mr.S 연재마감의학계의 Spectaculum: 임상시험
Mr. S (필명) (연세대학교)
에스프리 연재마감실험을 해봅시다
에스프리 (필명)
이제욱 연재마감생명과학자 기초체력 다지기
이제욱 (오송첨단의료산업진흥재단, 신약개발지원센터)
위로가기
실험 홈  |  실험FAQ
 |  BRIC소개  |  이용안내  |  이용약관  |  개인정보처리방침  |  이메일무단수집거부
Copyright © BRIC. All rights reserved.  |  문의
트위터 트위터    페이스북 페이스북   유튜브 유튜브    RSS서비스 RSS
머크 광고