클로닝을 할 때 인서트는 피씨알을 했고 벡터는 실험실에서 보유한 벡터를 사용하였습니다. 서로다른 두개의 restriction enzyme을 사용해서 유전자를 클로닝했고, 이를 시퀀싱해본결과 tag부분과 유전자 시퀀스 부분이 일치하는 것을 확인했습니다. 이 construct를 이용해 단백질을 발현시키기 위해 발현용 RIL 균주에 transformation 시켰고 그결과 콜로니가 자랐습니다. 헌데 이 콜로니를 따내서 inoculation을 하면 자라질않습니다. 이상하다 싶어서 DNA를 전기영동 시켜본 결과 DNA band가 관찰되지 않았구요. DNA를 elution한 DW가 contamination된 것은 아닌가 싶어 시퀀싱 보냈던 샘플 남은 것을 반송 받았고 이를 가지고 다시 transformation 수행하였습니다. (TF후 남은 샘플을 전기영동 해본 결과 DNA가 있는것을 확인) 다시 transformation한 plate에서 콜로니를 따내서 다시 inoculation을 했는데 역시 자라질 않습니다.
일단은 처음 시퀀싱 보낼땐 확실히 DNA band가 있는것을 확인하였기 때문에 DNA 플라스미드가 존재하지 않았던것은 아닌것 같구요. 시퀀싱보낸 샘플 번호가 바뀌거나 한 경우도 아닌것같습니다(공벡터라도 시퀀싱은 다 되었으니까요). 지금으로서는 처음 문제는 DNA elution DW 였던 것 같은데, 두번째 transformation한 경우도 이러니 뭐가 문제가 되는건지 모르겠습니다.
DH10B나 RIL comp. cell의 경우 제가 쭈욱 클로닝을 하면서 쓰던 것들 이었구요. 문제는 없었습니다. 최근 벡터를 증폭시키기 위해 썼을때도 이상 없었구요..
항생제 문제인가 싶었는데.. 항생제 기능에 문제가 있었다면 컨탐된 셀이 자라면 자랐지 아예 안자라진 않을 것 같구요.. LB test tube를 너무 오래된걸 써서 그런건 아닌지, 혹은 이번에 LB premix 배지로 바꿨는데.. 혹시 LB배지의 문제인가 싶은 생각도 들기도 합니다.
일단은 다시 클로닝 들어간 상태인데요. 이런 문제가 생기니 답답하네요. 전문가 분들의 조언 부탁드립니다. ㅠㅠ 뭐가 문제일까요?