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1. 3~4개면 적당합니다. c-term 구조가 flexible하다면 더 짧아도 잘 붙을 겁니다.
제 기억에 XhoI으로 해서 붙이면 C-term뒤에 2개가 엑스트라로 붙고 HIs tag이 붙는 것 같은데요..
2. 상관없습니다.
3. 혹시나 해서 그런데...
NTA binding 조건이 잘못된것은 아닌지요?가령 lysis buffer에 EDTA, reducing agent, glycerol, 등등 binding에 방해를 주는 것이 들어있는지요..
insoluble한 protein인 경우 lysis buffer에 Triton X-100 같은 detergent가 들어가면 좀 나아집니다.
다만 detergent가 나중에 반응에 문제가 될수 있습니다. 그리고 이런 degergent는 완전히 제거하기 힘듭니다. (NTA, gel filtration , dialysis등으로도 제거 어려움..)
제 경험에서도 N-term HIs tag이 잘 붙지 않을때, C-term으로 바꾸면 잘 붙는 경우가 있었습니다.