invitrogen의 bac to bac topo expression kit를 이용하여 recombinant bacmid를 만드려고 하고있습니다. 하지만 transposition이 제대로 일어나지 않는지 원하는 결과를 얻을 수가 없네요.
transposition을 위한 donor plasmid는 이미 제대로 만들어진것을 시퀀싱을 통해 확인을 했습니다. 만들어진 donor plasmid를 DH10bac E. coli com cell에 transformation을 하고 48시간 배양 후 화이트 콜로니를 따서 M13primer로 PCR을 돌리면 아무런 product가 나오지 않습니다. 비교하기 위해서 블루 콜로니를 따서 PCR을 같이 수행하였을 경우에는 transposition이 일어나지 않았을 경우 PCR product size인 350bp의 product가 확인이 됩니다.
transformation이 제대로 일어나지 않아 화이트 콜로니가 가짜라면 350bp의 product라도 나와야 할텐데 아무런 밴드조차 보이지 않으니 당황스럽습니다. 스프레딩시 희석배수를 높여서 콜로니의 수를 줄여서 하였을때도 결과는 별반 달라지지 않아서 문제점을 알 수 없어서 답답하네요.
한가지 걸리는 것이 bacmid를 prep하지 않고 colony로 PCR을 수행한 점인데, 이것 역시 블루콜로니는 colony PCR에서도 product가 나와서 왠지 이것도 큰 문제는 아닐것이라 생각됩니다.
모든 실험 과정은 처음인 관계로 프로토콜에 100프로 따라서 수행을 했는데도 원하는 결과가 나오지 않으니 답답하네요.(배지 및 항생제 농도, transforamation 조건, 배양 조건, PCR 조건 모두 프로토콜대로입니다. )