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 전체 > Molecular Biology-Protein > Western Blot Analysis
조회 3892  스크랩 인쇄하기 주소복사 트위터 공유 페이스북 공유 
질문 western을 했는데 잡band가..
알고싶어요  | 2002.05.19 00:00
답변있는 질문은 수정/삭제 불가(☞문의)
western을 했는데 band가..
안녕하세요
참이상한일이죠
제가 원하는 band뿐만아니라 다른band들이 많이 나옴니다..그것도 아주~ 선명하게
근데요 Ab문제는 아닌거 같아요
왜냐면요 제가 썼던 Ab를 다른사람이 그애로 재탕해서 썼거든요 그런데 그사람은 잘나왔어요
protein sample의 문제 같지도 않은것이 다른Ab를 붙여보면 잘나오건요..
저는 Washing도 0.2% tween 20의 TBST를 이용해서 1st Ab후에 10분씩 4번해주고요 2nd Ab후에 15분씩 4번이상을 해 주었거든요 blocking도 5%를 썼는데..
그런데 이유가 몰까요..
아시는분은 설명해주세요 궁금함니당..
저는 도저히 이유를 모르겠어요..
#western
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
전성규  |  2002.05.19    
님이 원하는 band 의 위치보다 위쪽에 있나요...?

아니면, 아랫쪽에 있나요...?


웨스턴 과정에 전혀 문제가 없다면...

위쪽 band 는 dimer 혹은 polymer 일 수 있습니다...
DTT 혹은 b-MeOH 의 양을 늘리시거나 좀더 확실히 끓여주시면 되겠고...

아랫쪽 band 는 proteolysis 가 일어나서 생긴 fragment 일 수 있습니다...
sample 준비시 PMSF 등의 protease inhibitor 를 사용하시길....


도움이 되셨길 기대합니다...


알고시퍼요  |  2002.05.19    
band의 위쪽에는 1개 아래쪽에는 3개정도가 있는데요 엄청나게 진하고 백그라운드는 깨끗합니다.
그럼 sample의 문제인가 보군요
윗쪽(60kD이상) size에서는 band가 잘나오는데 약 40~30kD정도에서 붙인것이 이렇게 band가 나왔어요 그럼 proteolysis 가 일어나서 생긴 fragment인건가요??
sample준비할때에는 PMSF뿐아니라 Na3VO4 NaF Aprotinin 등의 protease inhibitor들을 많이 쓰는데..
암튼 좀더 신경써서 sample을 준비해야겠어요.
도움이 정말 많이 됐습니다.
감사합니다. ^^
eeNo  |  2002.05.19    
좀 엉뚱하게 들릴지도 모르겠지만,모든 실험적 error를 제거한 후에도
보고자 하는 단백질 보다 위에(혹은 아래에) 있는 band의 경우는
post-translational modification의 영향일 가능성이 높습니다.
단백질을 얻은 source가 eukaryotes이라면 더더욱 그렇구요.
당장은 그런 류의 실험에 접근하기 힘들겠지만, 계속해서 그 단백질을 연구하고자
하신다면 한번쯤 고려해 보시는 것도 괜찮을 듯 싶네요.
riceo  |  2002.05.19    
--> 제 생각으론 washing이 문제 일수 있을 것 같군요.
TBST를 쓰는데, TBST는 PBST에 비하여 salt contcentration이 낮아 좀 mild한 편이죠.
우선은 antibody 마다 다르지만, 다른 사람이 TBST인지 PBST인지 확인하시고, TBST라면, primary 붙인 후, secondary 붙인 후 washing time을 좀 늘려 보시지요.
아니면, secondary antibody의 dilution이 다른 사람과 다른지도 확인해 보시고요.
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