Hi, even I can read and write korean character in my PC, I just want to answer in (broken) english for fun. 농담이구요. -.-;;

간단하게 확인해 볼 내용들.

- 클론이 뒤바뀌거나 잘못된 클론일 가능성은 없나요? 이런 경우는 종종 일어납니다. 클로닝하여 시퀀싱을 맡기고 얻은 결과를 내가 원하는 유전자와 blast2seq 를 해 보니 안나와서 그냥 blast를 돌려봤더니 옆의 애가 실험하는 클론이 나온다든지 -.-;; 시퀀싱해보십시오.

- 이렇게 많은 Enzyme 조합을 사용하였는데 모든 Enzyme이 다 맛이 갔다거나 (냉장고는 튼튼하죠?) Buffer Exchange 에서의 문제가 생기기는 힘들 것입니다. 혹시 자르는 데 사용한 Enzyme이 MCS에 있는 것이라면 유전자 내부와 Vector 에 하나씩 있는 Restriction Site를 골라서 ''single cut'' 으로 클론이 맞는지 확인해 보십시오.

매드.. 님 말 처럼 정말 이상하네요. 이렇게 많은 조합을 사용했는데도 안되다니요.

근데, 정말 더 이상한 건, 엔자임 조합을 보면 두개 다 완전히 다른 데도 여전히 싱글 밴드라는 말이죠? 정확히 싱글 밴드 하나만 나왔다면 싱글 컷은 일어 났다는 말인데, 항상 넣어 주는 엔자임 중 하나는 자르고 있다?.. 좀 이상하네요.
컨트롤로 엔자임 처리 안한 플라즈미드도 걸어 봤나요? 일반적인 것처럼 밴드가 두어 개 나오는데, 엔자임 처리한 것만 6.2의 싱글 밴드가 뜨는 건가요? 아니면 컨트롤도 저 위치에 하나만 뜬다면 벡터에 문제가 있지 않을까요?

먼저 하나씩만 처리 한 뒤에 컨트롤과 비교해서 어떤 엔자임이 확실히 잘라 주는 지부터 확인해야하지 않을까요..

일부 gel extraction후에는 제대로 잘리지 않는 경우가 있는 걸로 알고 있습니다. BamH1으로 일단 자르시고, 일부를 control로 남긴후 나머지는 phenol extraction 하신 후에 BspE1으로 자르고, 함께 결과를 확인해 보시면 어떨까요??

thanks a lot all. I will try the sequencing plus doulbe cuts at the same time ( I have already done and am waiting for the result now) and will let you know the result.

and to mad scientist : this was actually the cut within the gene and the cut in the vector. it''s a bit weird the cut in the vector was not properly done, ( although I can''t say exactly this is correct..)but I was successful for double cuts for subcloning this gene before. but at that time, i cut together because the buffer for restriction enzymes was the same.

Hello people,
Just let you know that I used totally different sets of restriction enzymes (stuI + XbaI) and this time it worked! Thanks for all suggestions!