음.. 엔자임 사이트를 바꾸면 안되는 상황이신거겠죠??
일단 둘 사이가 너무 가까워서 안 먹힌다고 보겠습니다...(다른 이유를 생각해내질 못하겠네요 ㅠ)
그럼 둘 사이의 거리를 늘려주면 되지 않을까요???
실험실에 적당한 사이즈의 샘플로 xho1 or hind3로 PCR 떠서
vectro 원컷 이후에 넣어서 둘 사이의 거리를 늘려준뒤
원하시는 스텝으로 넘어가시면 될거 같은데요...??
12nt면 BamHI이나 XhoI이 안잘릴 정도는 아닙니다.
제 생각은 BamHI처리 후 정제할때 DNA 가 좀 더러워졌던가 phenol이 완전히 제거되지 않았던가 하는 문제가 아닌가 싶군요.
두 효소 모두 잘리는것을 확인했으니 효소 문제는 아닌것같습니다.
ligation시킬 insert가 oligo인 모양이죠?
혹시 두 oligo를 annealing시키는 단계가 문제가 되지 않을까요?
확인해 보세요.
그리고 모든 종류의 실험에는 나중에 어느 단계에서 잘못되었는지를 확인할 수 있는 control을 반드시 같이 해야합니다.
그렇지 않으면 실험이 끝나고 이유도 모르고 첨부터 다시 잘못된 실험을 반복할 수 밖에 없습니다.
반드시 control을 디자인해보세요.
oligo를 넣는 ligation이라면 두개의 oligo 를 같은 농도로 섞어서 boiling-chilling하는 단계에 신경 써야 합니다.
또한 oligo 끼리는 self-ligation이 되지 않으므로 vectro는 CIP를 처리해서도 안됩니다.
벡터에 BamHI 처리- 정제 - XhoI 처리 - 농도확인.
oligo를 같은 농도로 섞어서 boiling - chilling
1. 벡터만 self ligation 한것
2. 벡터를 ligation하지 않은것
3. 벡터에 다양한 농도의 insert를 ligation 한것들.....
4. DW만.
5. 자르지 않은 supercoil plasmid 벡터 - ligation하는 자른 벡터와 같은 양
이렇게 준비해서 transformation을 해야합니다.
결과가 좋은 경우의 colony수는
1. 0 - 24
2. 0 - 3
3. 1,294
4. 0
5. 1,297,394 입니다.
1에서는 colony가 안나와야 이론적이나 실제로는 조금 나올 수 밖에 없습니다.
1과 2에서 colony가 비슷한 숫자가 나오면, ligase가 맛이 간겁니다.
1 > 2 가 정상입니다.
3에서는 1보다 훨씬 많은 colony가 나와야 합니다.
그래야 insert가 들어간 것입니다.
1 = 3 이면 insert가 안들어간겁니다.
4에서 colony가 나오면 comp cell이 오염된겁니다.
5에서 colony가 적게 나오명 comp cell의 효율이 개판인겁니다.
이렇게 control을 함께하면 실험이 꽝나도 ligase가 문제인지, 벡터가 문제인지 감을 잡을 수 있습니다.
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살려주세요
(비회원)
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11.09.06 16:11
답변 감사드립니다.
1. 벡터만 self ligation 한것
2. 벡터를 ligation하지 않은것
3. 벡터에 다양한 농도의 insert를 ligation 한것들.....
4. DW만.
5. 자르지 않은 supercoil plasmid 벡터 - ligation하는 자른 벡터와 같은 양
실험이 너무 안나와서, 1. 벡터만 self lig한것, 3. insert ligation한것, 4.DW와 5.plasmid vector 컨트롤 실험 수행했었습니다.
그 결과 컴셀이 컨탐된 문제가 아니었고, 컴셀효율도 떨어지지 않는것을 확인했습니다.
1번과 3번의 경우 비슷한 양의 콜로니가 나왔고 이들 중 3.insert ligation한 것들을 시퀀싱해보았을때 deletion되지 않은 벡터의 full 시퀀스가 나온것을 보면, 벡터가 아예 잘리지 않았거나 더블컷이 제대로 되지 않아 self ligation된것으로 보입니다..
엔자임을 순차적으로 자를때, 하나의 엔자임을 처리한 후 이것이 완전히 잘린것을 gel running을 통해 확인했기 때문에, 벡터가 아예 잘리지 않았을 경우는 배제하였고 벡터가 더블컷이 안되는거라 여겼던 것이지요..
왜 더블컷이 되지 않는것일까요.................. ㅠㅠ
너무 답답합니다..