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 전체 > Molecular Biology-DNA > Sequencing
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질문 colony pcr후 miniprep결과가 안나와요..ㅠ 도와주세요..ㅠ
무료확인  | 2011.08.31 22:32
답변있는 질문은 수정/삭제 불가(☞문의)
첨부파일 파일첨부: gel picture.jpg (22 KB)
이미지 첨부파일

안녕하세요 ..  저는 이번에 석사를 들어온 학생입니다.
현재 클로닝을 하고 있습니다.
pGEX-4T-1 이라는 vector에 약 90 bp의 insert를 ligation하기 위해 시도를 하고 있습니다.

ligation후 colony pcr을 한뒤에 전기영동으로 insert가 나온것을 확인하였습니다.
그 뒤로 miniprep을 한 뒤 enzyme cutting을 하였는데.. insert가 나오지 않습니다..

이전에 실험을 하였을때도 그런 경험이 있어서
miniprep한것과 enzyme cutting을 한것을 같이 로딩을 해 보았는데,
 miniprep 결과물이 사이즈가 너무 크게 나옵니다...

콜로니 피씨알까지 돌았는데. 왜 미니프렙이 잘 안될까요..
혹시 사이즈가 작아서 그런걸까요?
엔자임 컷팅을 할 떄는 다른 것과 같이 하여 다른것이 잘린것을 확인하였습니다,
4시간동안 충분히 잘라주었는데, 혹시나 사이즈가 작아서 잘 안잘리는 걸까요??

첨부 사진을 보시면
제일 왼쪾에 있는 사진이 미니프렙과 컷팅을 한 사진입니다.
보시다시피 첫번쨰 샘플이 마커의 제일 큰 녀석보다 위에 나옵니다,
두번쨰 샘플은 벡터로 사이즈가 맞게 나온것 으로 생각이 됩니다만 인설트가 없습니다..

중간에 있는 사진이 바로 콜로니 피씨알을 돌린 결과물 입니다.
사이즈가 90인데 마커의 100보다 크게나와서 이상해서 시퀀싱을 보냈더니
맞다고 나옵니다. 이 이유도 왜 그런지 모르겠습니다..ㅠㅠ

세번쨰 사진이 두번쨰 사진의 콜로니 피씨알 결과물을 미니프렙한후 엔자임컷팅을 한것입니다.
보시다시피 인설트가 나오질 않습니다...
약해서 그런가 싶어 좀 밝에 찎어도 나오지 않습니다..ㅠㅠ

왜 그런걸까요 ㅠㅠ..

#miniprep
 
#colony pcr
 
#전기영동
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
개구리DLM  |  2011.09.01   
insert 사이즈가 90이라도 colony PCR을 하면 그 insert보다 큰 PCR product가 나옵니다.
왜냐하면 colony PCR을 할 때에 사용하는 M13 F/R primer는 vector 상에 존재하는 시퀀스에 annealing을 하는 것이고, colony PCR product의 앞뒤에는 vector의 시퀀스가 일부 붙게 되기 때문입니다.
colony PCR에 어떤 primer를 사용했느냐에 따라 colony PCR product의 크기는 달라질 수 밖에 없습니다.
만약 insert 자체를 증폭했던 primer를 다시 사용하셨다면 당연히 insert와 동일한 크기가 나오겠죠.
어쨌든 colony PCR 결과상 insert는 들어갔는데(시퀀싱으로도 확인됨)
enzyme cutting을 해보니 insert가 안나온다면
제한효소로 cutting하는 과정의 문제라고 생각을 해야 할 것 같은데요.
1. 제한효소가 작동을 안함(변질, 버퍼, 반응조건 등의 문제)
2. vector에 그 제한효소 site가 없음- 제한효소를 잘못 고름
3. vector에 비해 insert의 크기가 심하게 작기 때문에 vector는 visualization될만한 양이더라도 insert는 잘 안보일 우려도 있음 (충분히 밝게 찍어서 확인했다면 이 문제는 배제가능)
4. insert 시퀀스 내부에 해당 제한효소로 잘리는 부위가 1-2개 이상 존재
(insert가 또다시 여러번 잘려 더 작은 DNA fragment가 되면 전기영동에서 확인하기 매우 어려워집니다.)
엘피스바이오텍  |  2011.09.01    
pGEX4T1 : 4900bp
Insert : 90bp

Size 비율 : 55배

EtBr에서 볼 수 있는 최소량 : 5-10ng

따라서 500ng 정도는 잘라야 insert이 겨우 보일 정도가 됩니다.
사진을 보니 loading양이 많아야 100ng정도이므로 EtBr염색에서는 보일 수 없습니다.
Restriction enzyme의 잘못이 아닙니다.

PCR을 하는 원래의 size보다 위에 나올 수 있습니다. PCR 용액에 들어 있는 각종 salt와 protein들에 의해 나타나는 현상으로 정제를 하면 원래의 size가 됩니다.

전체적으로 사진에 size에 대한 표시가 없어 뭐라 단언하긴 힘들지만, mini-prep이 정확했을 때 size가 원래보다 2-3배 이상 커질 수는 없습니다. 물론 concatemer의 형성에 의해 size변화가 올 수는 있지만 (이경우에는 enzyme으로 자르면 원래의 size가 됩니다) 그렇지 않고 size가 여전히 다르다며 이는 cloning artifact입니다. 사용하지 않는 것이 좋습니다.
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