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질문 Gel extraction 급합니다..
초심  | 2005.08.26 00:00
답변있는 질문은 수정/삭제 불가(☞문의)
gel extraction을 할려고 하는데요..
처음에 로딩은 66마이크로(3.8/2.8kb) 그람을 로딩하였습니다.
한 lane당 6마이크로 총 11 lane해서 66마이크로 그람을 하엿습니다,
근데 제가 extraction하고 싶은 부분은 3.8인데요
2.8이랑 넘 붙어있어서 30v에서 거의 20시간 정도 내리면 거의 떨어집니다.
혹시나 아랫부분이 딸려올까봐 밑에 부분은 과감히 잘라버리고 gel extraction하였습니다.
근데 qiagen kit로 마지막에 녹여보면 아무리 2.8이 반정도 짤려나갔다고해도 마지막에 얻어지는건 11마이크로 그람 정도입니다.
제 예상으로는 66중에서 반정도(2.8kb) 버리면 36정도 얻고 이걸 다시 gel extraction하면 적어도 20마이크로 그람을 얻어야하는데..너무 로스가 많아서요..


gel extraction 방법은요.,
1. 젤 무게당 QC 버퍼를 3배정도 넣고 50도에서 10분간 충분히 흔들어서 녹입니다.
2. 다음 젤 무게에 해당하는 isopropanol을 넣구요. 섞어줍니다.
3. 컬럼에 이 샘플을 로딩하여 1분간 13,000rpm에서 돌립니다.
다음 아래 액을 버리고 그 컬럼에 다시 샘플을 로딩합니다.
한 컬럼에 다 모으게 되면 그만큼 로스가 적을것같아서요
4. 다음 거기에 다시 QC버퍼를 0.5ml정도 넣고 13,000rpm에서 1분간 돌립니다.
5. 다음 PE 버퍼를 넣고 13,000rpm에서 1분 30초간 돌립니다.
6. 마지막에 DW 20 마이크로 리터를 넣고 elution합니다.

이 과정중에 제가 혹시 잘못한게 있나요?
아님 왜 그렇게 loss가 많은가요?...
원래 loss가 많은지요?..
한번 60마이크로 그람을 내리는데 전기영동20시간 정도 걸리는데 얻는건 10마이크로 그람이고..
제가 얻어야 하는거 100인데..도대체 머가 잘못된건지..누가 좀 도와주세요..
#Gel extraction
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
지나아빠  |  2005.08.26    
참고하시라고...

3.8kb와 2.8kb면 분리가 가능할텐데 아마도 너무 많은 양을 load하여서 떨어지는데 시간이 걸리나보군요.
만약 sequence를 아신다면 3.8kb에는 없고 2.8kb내에는 있는 제한효소를 찾으셔서 그걸로 자르세요. 그러면 3.8kb를 잘라내는데 그리 시간을 오래 소요하지 않으셔도 될거라고봅니다.

내가 알기로는 Qiagen kit에서 3.8b정도면 isopropanol을 넣지않는 것으로 알고 있는데? 다시한번 확인하시고요..
그리고 column membrane에 DNA가 붙을수 있는 기회를 더 제공하려면 한번 pass 했던것을 다시한번 cloumn에 pass시키는 것도 loss를 줄일수 있는 방법중의 한가지입니다.
그리고 elution을 20ul로 한것은 너무 적은 부피로 하신 것으로 생각됩니다.
column에서 elution하는 경우 column 내의 membrane을 모두 적셔주기에는 20ul는 너무 적습니다.최소 30- 기본이 50ul이상은 하여야 elution을 효과적으로 할수 있습니다.아마 다시 DW를 넣고 elution하시면 elution 되어 나오는 양도 상당히 있을것으로 생각되는군요.

다른 분이 말씀하신것처럼 column의 capacity도 고려하여야 합니다.
Gel extraction kit에 보면 loss가 거의 없다라고하지만 어느정도의 loss는 고려하셔야합니다.




friendsse  |  2005.08.26    
1.하나의 column을 쓰신다고 했는데, column의 용량은 고려하신 것인지요? 용량이 10ug이더군요.
2. 어느 정도 %의 gel을 쓰시는지? 이것도 분리하는데 영향을 많이 줄것입니다.
3. elution 하실 때 시간이나 온도를 조금 늘리거나 높이는 것도 수율에는 도움이 될
것 같습니다.
4. 그리고, 혹시 가능하시다면 glass bead type을 쓰시면 수율을 훨씬 올릴 수 있으시라라 생각합니다.
초심  |  2005.08.26    
3번의 항목에 elution 시간이랑 온도늘 높여 보라고 하셨는데요..
마지막에 elution할때 buffer 온도를 80도 정도로 데운다음에 그걸 컬럼에 넣고 바로 내리지 말고 한 30초정도 있은다음 centrifuge를 하여야하나요?
혹시 제가 elution buffer를 안쓰고 DW를 쓴게 문제인가요?
그래서 이번에는 EB(kit안에 있는 elution buffer)를 80도 정도 데워서 넣은 다음 30초 뒤에 elution할려고 생각중이거든요..
더 수율이 높아질가요?
friendsse  |  2005.08.26    
이전 답변에서 말씀드린 것 처럼 column의 용량을 초과하여 사용하고 계십니다.
따라서 20ug이상의 양을 원하시면 3개 정도의 column에 나눠서 정제하셔야 할 겁니다.
elution할 때는 그냥 물을 써도 그리 큰 영향은 없으나, EB가 효율이 조금 더 좋더군요.
1-2분정도 heat block에서 반응 후 elution하시는 것이 좋을 듯 합니다. 그런데 80도는 너무 높은 것 같구요. 60도 정도가 DNA 안정성에는 더 적합할 듯 합니다.
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